Polymerase-Kettenreaktion

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Overview

Polymerase Chain Reaction (PCR) is a method for amplifying (creating multiple copies of) DNA without using a living organism, such as E. coli or yeast. PCR is commonly used in medical and biological research labs for a variety of tasks, such as the detection of hereditary diseases, the identification of genetic fingerprints, the cloning of genes, and paternity testing.

Überblick

Die Polymerase-Kettenreaktion (kurz: PCR für Polymerase Chain Reaction) ist eine Methode, um DNS zu vervielfältigen, ohne einen lebenden Organismus, wie z.B. E. coli oder Hefe zu benutzen. PCR wird in biologischen und medizinischen Laboratorien für eine Vielzahl verschiedener Aufgaben verwendet, zum Beispiel für die Erkennung von Erbkrankheiten, für das Erstellen und Überprüfen genetischer Fingerabdrücke, für das Klonieren von Genen und für Vaterschaftstests.

History

PCR was invented in the early 1980s by Kary B. Mullis (Fig. 1). Mullis was awarded the Nobel Prize in Chemistry in October 1993 for this achievement, only seven years after he first published his ideas. Mullis's idea was to develop a process by which DNA could be artificially multiplied through repeated cycles of duplication driven by an enzyme called DNA-Polymerase.

Geschichte

Die Polymerase-Kettenreaktion wurde in den frühen 1980er Jahren von Kary B. Mullis (Abb. 1) entwickelt. Nur sieben Jahre nachdem er seine Idee veröffentlicht hatte, wurde Mullis hierfür der Nobelpreis für Chemie verliehen. Seine Idee war es, ein Verfahren zu entwickeln, das DNS durch wiederholte Verdoppelung in mehreren Zyklen mit Hilfe eines Enzyms namens DNS-Polymerase künstlich vervielfältigt.

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Figure 1 : Kary B. Mullis, inventor of the Polymerase Chain Reaction.
(Photo by Gary Meek/Georgia Tech Alumni Magazine)

Abbildung 1 : Kary B. Mullis, Erfinder der Polymerase-Kettenreaktion.
(Foto von Gary Meek/Georgia Tech Alumni Magazine)

DNA-Polymerase occurs naturally in living organisms, where it functions to duplicate DNA when cells divide. It works by binding to a single DNA strand and creating the complementary strand. In Mullis's original PCR process, the enzyme was used in vitro (in a controlled environment outside an organism). The double-stranded DNA was separated into two single strands by heating it to 96°C. At this temperature, however, DNA-Polymerase was destroyed so that the enzyme had to be replenished after the heating stage of each cycle. Mullis's original PCR process was very inefficient since it required a great deal of time, vast amounts of DNA-Polymerase, and continual attention throughout the PCR process.

DNS-Polymerase kommt in allen Lebewesen vor, sie verdoppelt die DNS vor der Zellteilung. Sie bindet sich an einen einzelnen DNS-Strang und erzeugt einen dazu komplementären Strang. In Mullis' ursprünglichem PCR-Versuch wurde das Enzym in vitro (in einer kontrollierten, künstlichen Umgebung) verwendet. Die doppelsträngige DNS wurde durch Erhitzen auf 96°C in zwei Einzelstränge aufgeteilt. Bei dieser Temperatur wurde die DNS-Polymerase zerstört und musste daher nach jedem Erhitzen erneuert werden. Mullis' ursprüngliches Verfahren war sehr ineffizient, da es viel Zeit, große Mengen DNS-Polymerase und ständige Aufmerksamkeit erforderte.

Later, this original PCR process was improved by the use of DNA-Polymerase taken from thermophilic (heat-loving) bacteria that grow in geysers at a temperature of over 110°C. The DNA-Polymerase taken from these organisms is thermostable (stable at high temperatures) and, when used in PCR, did not break down when the mixture was heated to separate the DNA strands. Since there was no longer a need to add new DNA-Polymerase for each cycle, the process of copying a given DNA strand could be simplified and automated.

Später wurde der PCR-Prozess verbessert, indem man DNS-Polymerase die von thermophilen (Hitze liebenden) Bakterien verwendete, die bei über 110°C in Geysiren leben. Die DNS-Polymerase dieser Lebewesen ist thermostabil (stabil bei hohen Temperaturen) und wurde daher beim Erhitzen während der PCR-Zyklen nicht zerstört. Da nicht mehr ständig neue DNS-Polymerase hinzugefügt werden musste, konnte der der Vervielfältigungs-Vorgang erheblich vereinfacht und automatisiert werden.

One of the first thermostable DNA-Polymerases was obtained from Thermus aquaticus and called Taq. Taq polymerase is widely used in current PCR practice (May 2001). A disadvantage of Taq is that it sometimes makes mistakes when copying DNA, leading to mutations (errors) in the DNA sequence. Polymerases such as Pwo or Pfu, obtained from Archea, have proofreading mechanisms (mechanisms that check for errors) and can significantly reduce the number of mutations that occur in the copied DNA sequence.

Eine der ersten thermostabilen DNS-Polymerasen wurde aus Thermus aquaticus gewonnen und Taq genannt. Taq-Polymerase erfährt gegenwärtig (Mai 2001) breite Anwendung. Ein Nachteil der Taq-Polymerase liegt darin, dass sie manchmal Fehler beim Kopieren der DNS produziert, was zu Mutationen (Fehlern) in der DNS-Sequenz führt. Polymerasen wie Pwo oder Pfu, die aus [[Archea]] gewonnen werden, haben einen Korrektur-Mechanismus, der die Anzahl der Mutationen in der kopierten DNS erheblich senkt.

PCR in Practice

PCR is used to amplify a short, well-defined part of a DNA strand. This can be a single gene, or just a part of a gene. As opposed to living organisms, the PCR process can copy only short DNA fragments, usually up to 10 kb (kb=kilo base pairs=1000 base pairs). (DNA is double-stranded, and therefore, it is measured in complementary DNA building blocks (nucleic acids) called base pairs.) Certain methods can copy fragments up to 40 kb in size, which is still much less than the chromosomal DNA of a eukaryotic cell--for example, a human cell contains about three billion base pairs.

PCR in der Praxis

PCR wird eingesetzt um einen kurzen, genau definierten Teil eines DNS-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens handeln. Im Gegensatz zu lebenden Organismen kann der PCR-Prozess nur kurze DNS-Abschnitte bis zu ca. 10 kbp (10.000 Basenpaare) DNA ist doppelsträngig, und daher wird ihre Länge in komplementären DNA-Bausteinen (Nukleinsäuren) oder Basenpaaren gemessen. kopieren. Mit Hilfe bestimmter Verfahren können Fragmente bis zu einer Länge von 40 kbp vervielfältigt werden, was immer noch sehr viel weniger ist als die chromosomale DNS einer eukaryotischen Zelle - eine menschliche Zelle enthält beispielweise etwa drei Milliarden Basenpaare.

PCR, as currently practiced, requires several basic components. These components are:

DNA template, which contains the region of the DNA fragment to be amplified

Two primers, which determine the beginning and end of the region to be amplified (see following section on primers)

DNA-Polymerase, which copies the region to be amplified

Nucleotides, from which the DNA-Polymerase builds the new DNA

Buffer, which provides a suitable chemical environment for the DNA-Polymerase

In ihren momentanen Anwendungsgebieten benötigt PCR mehrere grundlegende Komponenten. Diese sind:

Die Original-DNS, die den zu vervielfältigenden Abschnitt enthält

Zwei Primer, um Anfang und Ende des zu vervielfältigenden Abschnitts festzulegen (siehe auch den Abschnitt "Primer")

DNS-Polymerase, um den festgelegten Abschnitt zu kopieren

Nukleotide, die Bausteine für den von der DNS-Polymerase synthetisierten DNS-Strang

Puffer, die eine für die DNS-Polymerase geeignete chemische Umgebung sicherstellen

The PCR reaction is carried out in a thermocycler. This is a machine that heats and cools the reaction tubes within it to the precise temperature required for each step of the reaction. To prevent evaporation of the reaction mixture, a heated lid is placed on top of the reaction tubes or a layer of oil is put on the surface of the reaction mixture.

Die Polymerase-Kettenreaktion findet in einem so genannten Thermocycler statt. Diese Maschine erhitzt und kühlt die in ihr befindlichen Reaktionsgefäße präzise auf die Temperatur, die für den jeweiligen Schritt benötigt wird. Um Verdunstung zu verhindern, wird ein beheizbarer Deckel auf den Reaktionsgefäßen oder eine Ölschicht auf dem Reaktionsgemisch benutzt.

Primers

The DNA fragment to be amplified is determined by selecting primers. Primers are short, artificial DNA strands--not more than fifty nucleotides (Since DNA is usually double-stranded, its length is measured in base pairs. The length of single-stranded DNA is measured in bases or nucleotides.) --that exactly match the beginning and end of the DNA fragment to be amplified. They anneal (adhere) to the DNA template at these starting and ending points, where the DNA-Polymerase binds and begins the synthesis of the new DNA strand.

Primer

Das zu vervielfältigende DNS-Fragment wird durch die Primer bestimmt. Primer sind kurze künstlich erzeugte DNS-Stränge, die weniger als 50 Nukleotide lang sind (Da DNS normalerweise doppelsträngig ist, wird die Länge in Basenpaaren gemessen. Die Länge eines einzelnen DNS-Strangs wird in Basen oder Nukleotiden gemessen.) und exakt mit dem Anfang bzw. dem Ende des zu vervielfältigenden DNS-Teils übereinstimmen. An der Ausgangs-DNS lagern sie sich an den Start- und Endpunkten an, die von der DNS-Polymerase für die Synthetisierung des neuen DNS-Strangs benutzt werden.

The choice of the length of the primers and their melting temperature depends on a number of considerations. The melting temperature of a primer--not to be confused with the melting temperature of the DNA in the first step of the PCR process--is defined as the temperature below which the primer will anneal to the DNA template and above which the primer will dissociate (break apart) from the DNA template. The melting temperature increases with the length of the primer. Primers that are too short would anneal at several positions on a long DNA template, which would result in non-specific copies. On the other hand, the length of a primer is limited by the temperature required to melt it. Melting temperatures that are too high, i.e., above 80°C, can also cause problems since the DNA-Polymerase is less active at such temperatures. The optimum length of a primer is generally from thirty to forty nucleotides with a melting temperature between 60°C and 75°C.

Wie man die Länge und der Schmelzpunkt der Primer festlegt, hängt von einer Reihe von Faktoren ab. Der Schmelzpunkt eines Primers - nicht zu verwechseln mit dem Schmelzpunkt der DNS im ersten Schritt des PCR-Prozesses - bestimmt die Temperatur, unterhalb der der Primer sich an die Ausgangs-DNS anlagert. Wird der Schmelzpunkt überschritten, löst sich der Primer wieder von der Vorlage. Der Schmelzpunkt steigt mit zunehmender Primer-Länge. Sollte ein Primer zu kurz sein, kann er sich an verschiedenen Stellen der DNS anlagern, wodurch man den zu vervielfältigenden Bereich nicht mehr genau bestimmen könnte. Auf der anderen Seite ist die Länge des Primers durch die zum Erreichen des Schmelzpunkts benötigte Temperatur begrenzt. Ist der Schmelzpunkt zu hoch, d.h. über 80°C, kann das zu Problemen führen, da DNS-Polymerase bei solchen Temperaturen weniger aktiv ist. Die optimale Länge für den Primer liegt im Allgemeinen zwischen 30 und 40 Nukleotiden bei einem Schmelzpunkt zwischen 60°C und 75°C.

Procedure

The PCR process consists of a series of twenty to thirty cycles. Each cycle consists of three steps (Fig. 2). First, the double-stranded DNA has to be heated to 96°C in order to separate the strands. This step is called melting; it breaks apart the hydrogen bonds that connect the two DNA strands. Prior to the first cycle, the DNA is often melted for an extended time to ensure that both the template DNA and the primers have completely separated and are now single-strand only.

Ablauf

Der PCR-Prozess besteht aus einer Serie von 20 bis 30 Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten (Abb. 2). Zunächst wird die doppelsträngige DNS auf 96°C erhitzt um die Stränge zu trennen. Dieser Schritt wird Melting; (Schmelzen) genannt. Die Wasserstoff-Verbindungen, die die beiden DNS-Stränge zusammenhalten, werden aufgebrochen. Im ersten Zyklus wird die DNS oft für längere Zeit erhitzt um sicherzustellen, dass sich sowohl die Ausgangs-DNS als auch die Primer vollständig aufgetrennt haben und nur noch aus einem Strang bestehen.

After separating the DNA strands, the temperature is lowered so the primers can attach themselves to the single DNA strands. This step is called annealing. The temperature of this stage depends on the primers and is usually 5°C below their melting temperature. A wrong temperature during the annealing step can result in primers not binding to the template DNA at all, or binding at random.

Nach der Trennung der Stränge wird die Temperatur gesenkt, so dass die Primer sich an die einzelnen DNS-Stränge anlagern können. Dieser Schritt heißt Annealing (Anlagerung). Die Temperatur während dieser Phase hängt von den Primern ab und liegt normalerweise 5°C unter ihrem Schmelzpunkt. Wird die Temperatur falsch gewählt, kann das dazu führen, dass die Primer sich nicht oder an der falschen Stelle an der Ausgangs-DNS anlagern.

Finally, the DNA-Polymerase has to fill in the missing strands. It starts at the annealed primer and works its way along the DNA strand. This step is called elongation. The elongation temperature depends on the DNA-Polymerase. The time for this step depends both on the DNA-Polymerase itself and on the length of the DNA fragment to be amplified.

Letztendlich füllt die DNS-Polymerase die fehlenden Stränge. Sie beginnt am angelagerten Primer und folgt dann dem DNS-Strang. Dieser Schritt heißt Elongation (Verlängerung). Die Temperatur hängt nun von der DNS-Polymerase ab, die Zeit, die dieser Schritt benötigt, von der DNS-Polymerase und der Länge des DNS-Fragments, das vervielfältigt werden soll.

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Figure 2 : Schematic drawing of the PCR cycle.
(Image created by the author and donated to Nupedia.)
(1) Melting at 96°C. (2) Annealing at 68°C. (3) Elongation at 72°C (P=Polymerase). (4) The first cycle is complete. The two resulting DNA strands make up the template DNA for the next cycle, thus doubling the amount of DNA duplicated for each new cycle.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des PCR-Zyklus.
(Die Abbildung stammt vom Autor und wurde Nupedia zur Verfügung gestellt.)
(1) Schmelzen bei 96°C. (2) Anlagerung bei 68°C. (3) Verlängerung bei 72°C (P=Polymerase). (4) Der erste Zyklus ist beendet. Die beiden entstandenen DNs-Stränge bilden die Vorlage für den nächsten Durchlauf, die Menge an DNS verdoppelt sich also mit jedem neuen Zyklus.

Example

The times and temperatures given in this example are taken from a PCR program that was successfully used by Mr. Magnus Manske on a 250 bp fragment of the C-terminus of the insulin-like growth factor (IGF).

Beispiel

Die angegebenen Zeiten und Temperaturen dieses Beispiels stammen aus einem PCR-Programm, das von Magnus Manske erfolgreich zur Vervielfätigung eines 250-bp-Fragment des ??? der ??? eingesetzt wurde.

The reaction mixture consists of :

1.0 µl DNA template (100 ng/µl)
2.5 µl of primer, 1.25 µl per primer (100 ng/µl)
1.0 µl Pfu-Polymerase
1.0 µl nucleotides
5.0 µl buffer
89.5 µl H₂O

A 200 µl reaction tube containing the 100 µl mixture is inserted into the thermocycler.

Das Reaktionsgemisch besteht aus:

1.0 µl DNS-Vorlage (100 ng/µl)
2.5 µl Primer, 1.25 µl pro Primer (100 ng/µl)
1.0 µl Pfu-Polymerase
1.0 µl Nukleotiden
5.0 µl Puffer
89.5 µl H₂O

The PCR process consists of the following steps:

Step 1: Initialization. Heat the mixture at 96°C for 5 minutes to ensure that the DNA strands as well as the primers have melted. The DNA-Polymerase can be present at initialization, or it can be added after this step.

Der PCR-Prozess besteht aus folgenden Schritten:

Schritt 1: Initialisierung. Das Gemisch wird 5 Minuten lang auf 96°C erhitzt, um sicherzustellen, dass die DNS-Stränge und Primer sich getrennt haben. Die DNS-Polymerase kann vor oder nach der Initialisierung zugefügt werden.

Step 2: Melting. Heat at 96°C for 30 seconds. For each cycle, this is usually enough time for the DNA to melt.

Step 3: Annealing. Heat at 68°C for 30 seconds.

Step 4: Elongation. Heat at 72°C for 45 seconds.

Steps 2-4 are repeated 25 times.
With good primers and fresh polymerase, 15 to 20 cycles is sufficient.

Schritt 2: Schmelzen. Das Gemisch wird 30 Sekunden lang auf 96°C erhitzt. Das genügt gewöhnlich, um die DNS während den Zyklen zu schmelzen.

Schritt 3: Anlagerung. Das Gemisch wird 30 Sekunden lang auf 68°C erhitzt.

Schritt 4: Verlängerung. Das Gemisch wird 45 Sekunden lang auf 72°C erhitzt.

Die Schritte 2-4 werden 25 wiederholt.

Mit guten Primern und frischer Polymerase genügen 15 bis 20 Zyklen.

Step 5: Hold mixture at 7°C. This is useful if one starts the PCR in the evening just before leaving the lab, so it can run overnight. The DNA will not be damaged at 7°C after just one night.

The PCR product can be identified by its size using agarose gel electrophoresis. (Agarose gel electrophoresis is a procedure that consists of injecting DNA into agarose gel and then applying an electric current to the gel. As a result, the smaller DNA strands move faster than the larger strands through the gel toward the positive current.) The size of the PCR product can be determined by comparing it with a DNA ladder, which contains DNA fragments of known size, also within the gel (Fig. 3).

Schritt 5: Das Gemisch wird bei 7%deg;C aufbewahrt. Es bietet sich an, die PCR am Abend vor dem Verlassen des Labors einzuleiten, so dass sie über Nacht laufen kann. Die DNS wird bei 7°C nach nur einer Nacht nicht beschädigt.

Das PCR-Produkt kann durch ??? identifiziert werden. (??? ist eine Prozedur, bei der DNS in ??= injeziert und anschließend unter Strom gesetzt wird. Die kürzeren DNS-Stränge werden sich schneller als die längeren auf den Pluspol zubewegen.) Die Menge des PCR-Produkts kann durch einen Vergleich mit ???, die DNS-Fragmente bekannter Größe (auch in Gel) enthält, bestimmt werden

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Figure 3 : PCR product compared with DNA ladder in agarose gel.
(Image created by the author and published with permission of Helmut W. Klein, Institute of Biochemistry, University of Cologne, Germany)
DNA ladder (lane 1), the PCR product in low concentration (lane 2), and high concentration (lane 3).

Abbildung 3 : Das PCR-Product im Vergleich mit der ??? in ???.
(Das Bild wurde vom Autor erstellt und mit Genehmigung von Helmut W. Klein, Institut für Biochemie, Universität Köln, veröffentlicht)
??? (??? 1), das PCR-Product in niedriger Konzentration (??? 2) und hoher Konzentration (??? 3).

Uses of PCR

PCR can be used for a broad variety of experiments and analyses. Some examples are discussed below.

PCR-Anwendungsgebiete

PCR kann für eine Vielzahl von Experimenten und Analysen eingesetzt werden, einige Beispiele werden weiter unten vorgestellt.

Genetic Fingerprinting

Genetic fingerprinting is a forensic technique used to identify a person by comparing his or her DNA with a given sample, e.g., blood from a crime scene can be genetically compared to blood from a suspect. The sample may contain only a tiny amount of DNA, obtained from a source such as blood, semen, saliva, hair, etc. Theoretically, just a single strand is needed. First one breaks the DNA sample into fragments, then amplifies them using PCR. The amplified fragments are then separated using gel electrophoresis. The overall layout of the DNA fragments is called a DNA fingerprint.

Genetischer Fingerabdruck

Der genetische Fingerabdruck wird in der Gerichtsmedizin zur Identifikation einer Person eingesetzt. Seine oder ihre DNS wird mit einer vorhandenen Probe, beispielsweise kann eine Blutprobe von einem Verbrechensschauplatz mit dem Blut eines Verdächtigen verglichen werden. Die Probe muß nur geringe Mengen von DNS enthalten, die man aus Blut, Sperma, Speichel, Haaren oder ähnlichem gewinnen kann. Theoretisch genügt ein einziger Strang. Zuerst teilt man die DNS-Probe in Fragmente, die dann mittels PCR vervielfätigt werden. Die vervielfätigten Fragmente werden anschließend durch ??? getrennt. Die allgemeine Zusammensetzung der DNs-Fragmente nennt man DNS-Fingerabdruck.

Paternity Testing

Although these resulting "fingerprints" are unique (except for identical twins), genetic relationships, for example, parent-child or siblings, can be determined from two or more genetic fingerprints, which can be used for paternity tests (Fig. 4). A variation of this technique can also be used to determine evolutionary relationships between organisms.

Vaterschaftstest

Obwohl diese erzeugten "Fingerabdrücke" einzigartig sind (außer bei eineiigen Zwillingen), können genetische Beziehungen, zum Beispiel zwischen Eltern und Kindern oder zwischen Geschwistern durch zwei oder mehr genetische Fingerabdrücke bestimmt werden, was bei Vaterschaftstests zum Einsatz kommt (Abb. 4). Eine Abwandlung dieser Technik wird auch zur Bestimmung evolutionärer Beziehungen zwischen Organismen angewandt.

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Figure 4 : Electrophoresis of PCR-amplified DNA fragments.
(Image created by the author and donated to Nupedia.)
(1) Father. (2) Child. (3) Mother. The child has inherited some, but not all of the fingerprint of each of its parents, giving it a new, unique fingerprint.

Abbildung 4: ??? mittels PCR vervielfätigter DNS-Fragmente.
(Die Abbildung stammt vom Autor und wurde Nupedia zur Verfügung gestellt.))
(1) Vater. (2) Kind. (3) Mutter. Das Kind hat Teile der Fingerabrücke der beiden Elternteile geerbt wodurch es über einen eigenen, einzigartigen Fingerabdruck verfügt.

Detection of Hereditary Diseases

The detection of hereditary diseases in a given genome is a long and difficult process, which can be shortened significantly by using PCR. Each gene in question can easily be amplified through PCR by using the appropriate primers and then sequenced (To sequence DNA means to read the sequence of nucleotides (or bases) of the DNA.) to detect mutations.

Erkennung von Erbkranheiten

Die Erkennung von Erbkranheiten in einem vorliegenden Genom ist ein langwieriger und komplizierter Vorgang, der durch den Einsatz von PCR bedeutend verkürzt werden kann. Jedes GEn, das in Frage kommt, kann durch PCR mit den entsprechenden Primern ??? werden (??? DNS heißt, die Sequenz der ??? (oder Basen) der DNS zu lesen) um Mutationen aufzuspüren.

Viral diseases, too, can be detected using PCR through amplification of the viral DNA. This analysis is possible right after infection, which can be from several days to several months before actual symptoms occur. Such early diagnoses give physicians a significant lead in treatment.

Virale Erkrankungen können ebenfalls durch PCR erkannt werden, indem man die Virus-DNS vervielfältigt. Diese Analyse kann sofort nach der Infektion erfolgen, die Tage oder Wochen vor dem Ausbrcuh der Symptome

liegen kann. Erfolgt die Diagnose so früh, erleichtert das den Medizinern die Behandlung erheblich.

Cloning Genes

Cloning a gene--not to be confused with cloning a whole organism--describes the process of isolating a gene from one organism and then inserting it into another organism. PCR is often used to amplify the gene, which can then be inserted into a vector (A vector is a means of inserting a gene into an organism.) such as a plasmid (a circular DNA molecule) (Fig. 5). The DNA can then be transferred into a different organism where the gene and its product can be studied more closely. Expressing a cloned gene (To express a gene means to produce the protein that it determines the production of.) can also be a way of mass-producing useful proteins--for example, medicines.

Klonierung von Genen

Das Klonieren eines Gens -nicht zu verwechseln mit dem Klonen eines kompletten Organismus- ist ein Vorgang, bei dem ein Gen in einem Organismus isoliert und anschließend in einen anderen eingepflanzt wird. PCR wird oft benutzt, um das Gen zu vervielfältigen, das dann in einen Vektor (Ein Vektor ist ein Mittel mit dem ein Gen in einen Organismus verpflanzt werden kann), beispielsweise ein Plasmid (ein ringförmiges DNS-Molekül), eingesetzt wird (Abb. 5). Die DNS kann anschließend in einen anderen Organismus eingesetzt werden, in dem das Gen oder sein Produkt besser untersucht werden kann. Das Exprimieren eines klonierten Gens (Ein Gen zu exprimieren heißt, das Protein herzustellen, dessen Bauplan im Gen enthalten ist) kann auch zur massenhaften Herstellung nutzbarer Proteine - z.B. Arzneimitteln, dienen.

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Figure 5 : Cloning a gene using a plasmid.
(Image created by the author and donated to Nupedia.)
(1) Chromosomal DNA of organism A. (2) PCR. (3) Multiple copies of a single gene from organism A. (4) Insertion of the gene into a plasmid. (5) Plasmid with gene from organism A. (6) Insertion of the plasmid in organism B. (7) Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B.

Mutagenesis

Mutagenesis is a way of making changes to the sequence of nucleotides in the DNA. There are situations in which one is interested in mutated (changed) copies of a given DNA strand, for example, when trying to assess the function of a gene or in in-vitro protein evolution. Mutations can be introduced into copied DNA sequences in two fundamentally different ways in the PCR process. Site-directed mutagenesis</i> allows the experimenter to introduce a mutation at a specific location on the DNA strand. Usually, the desired mutation is incorporated in the primers used for the PCR program. Random mutagenesis, on the other hand, is based on the use of error-prone polymerases in the PCR process. In the case of random mutagenesis, the location and nature of the mutations cannot be controlled. One application of random mutagenesis is to analyze structure-function relationships of a protein. By randomly altering a DNA sequence, one can compare the resulting protein with the original and determine the function of each part of the protein.

Analysis of Ancient DNA

Using PCR, it becomes possible to analyze DNA that is thousands of years old. PCR techniques have been successfully used on animals, such as a forty-thousand-year-old mammoth, and also on human DNA, in applications ranging from the analysis of Egyptian mummies to the identification of a Russian czar.

For Further Reading

PCR
Newton, C. R. and A. Graham. PCR: Introduction to Scientific Techniques. 2d. ed. Oxford: BIOS Scientific Publishers Ltd., 1997.
Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. "Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase." Science 239 (1988): 487-491.
United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction
PCR Project: Making PCR (Polymerase Chain Reaction) at University of California, Berkeley (http://sunsite.berkeley.edu/PCR/)
Genetic Fingerprinting
Ballantyne, J., ed. DNA Technology and Forensic Science. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Billings, P. R., ed. DNA on Trial: Genetic Identification and Criminal Justice. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1992.
Saiki R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich, and N. Arnheim. "Enzymatic Amplification of Beta-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle-Cell Anemia." Science 230 (1985): 1350-1354.