T7-RNA-Polymerase

RNA-Polymerase (Phage T7)
Vorhandene Strukturdaten: s. UniProt
Bezeichner
Gen-Name(n)	1 (Entrez)
Externe IDs	UniProt P00573
Enzymklassifikation
EC, Kategorie	2.7.7.6, Nukleotidyltransferase
Substrat	Nucleosidtriphosphat + RNAn
Produkte	Diphosphat + RNAn+1
Vorkommen
Homologie-Familie	Hovergen
Übergeordnetes Taxon	Caudovirales

Die T7 RNA-Polymerase ist die RNA-Polymerase aus dem Phagen T7, einem Virus, der das Darmbakterium Escherichia coli befällt. Das Enzym spielt eine bedeutende Rolle in der Biotechnologie bei der Expression von rekombinanten Proteinen, vor allem in E. coli aber auch in Bacillus subtilis und in Pseudomonaden existieren Anwendungen.

Funktion

Die ersten RNA Transkripte des Phagen T7 werden mit der RNA Polymerase des Wirts durchgeführt. Darunter auch die Information für die Translation der sehr promotorspezifischen T7 RNA Polymerase. Die T7 eigene Polymerase erkennt nur ihren eigenen Promotor und ist deshalb eine sehr gute Methode den Stoffwechsel des Wirts zu assimilieren und für die eigene Reproduktion zu nutzen. Die T7 RNA Polymerase gilt in Kombination mit dem T7 eigenen Promotor als besonders „starkes“ Espressionsystem. Das bedeutet, dass mit diesem Promotor sehr viel RNA und als Folge davon häufig viel Protein pro Kopie auf einer DNA produziert werden kann. T7 Polymerase hat während der Elongationsphase der Transkription eine Nukleotidadditionsgeschwindigkeit von 200-260 Nukleotiden pro Sekunde (die normale E. coli RNA Polymerase erreicht etwa 40 Nukleotiden pro Sekunde).

Der T7 Promotor

Der T7 Promotor hat eine spezifische Sequenz:

TAATACGACTCACTATAGGGAGA

wobei die Transkription mit GGGAGA startet. Der Promotor verfügt über fast keine Basaltranskription. Das heißt bei Abwesenheit von T7 RNA Polymerase wird er so gut wie nicht abgelesen.

Anwendung in der Biotechnologie

Die stärke des T7 Expressionsystems machen den T7 Promotor und die T7 Polymerase sehr interessant für die Expression rekombinater Proteine. Daher existieren inzwischen diverse Vektoren zur Proteinexpression die das T7 System verwenden, wie etwa die pET Serie der Firma MERCK/NovaGene.

In der Regel befindet sich auf einem Vektor die T7 Promotorsequenz und dahinter (vor einer notwendigen RBS) die codierende Region für ein „protein of intrest“. Da ein solches Expressionssystem wegen der oben genannten Gründe nicht funktionsfähig wäre (da vom Expressionsorganismus keine T7 Polymerase produziert wird), muss die T7 Polymerase künstlich in das System eingebracht werden. Die häufigste Methode hierzu ist die genomische Verankerung einer T7 Expressionskassette im Produktionsorganismus. Der am häufigsten hierfür benutzte Organismus ist E. coli. Bei ihm bezeichnet man den entsprechenden Genotyp der eine genomische T7 Polymerase anzeigt mit (DE3), da die T7 Polymerase mit Hilfe des DE3 Prophagen ins Genom integriert wurde. Hierbei steht die Expression der T7 Polymerase unter Kontrolle des lacUV5 Promotors der mittels IPTG oder Lactose induziert werden kann.

Probleme bei der Verwendung von T7 Expressionssystemen

Es gibt mehrere Probleme die sich aus der Verwendung des T7 Expressionssystems ergeben:

Die verwendete, genomisch verankerte Expressionskassette für die T7 RNA Polymerase ist nicht „dicht“ man spricht hier von einer sogenannten Basaltranskription. Die Folge ist, dass so stets eine gewisse Menge an T7 Polymerase vorhanden ist die dafür sorgt, dass der Produktionsorganismus auch der der eigentlichen Induktion schon Proteinen exprimiert. Das ist vor allem bei toxischen Produkten sehr nachteilig und außerdem bedeutet es einen unnötige metabolische Belastung des Produktionsorganismus. Auch die Addition eines lac Operators auf dem Vektor zwischen Promotor und proteincodierender Sequenz zeigt hier wenig Erfolgt.

Eine weitere Methode ist die genomische Verankerung einer Lysozym Expressionskassette (Genotyp Bezeichnung in E. coli pLys) oder die Addition eines entsprechenden Plasmids . Lysozym bindet an die T7 Polymerase und hemmt diese. Allerdings bedeutet diese Methode ebenfalls eine zusätzliche Belastung für den Produktionso und sorgt nicht für optimale Ergebnisse im Bezug auf die Basaltranskription.

Die neuste Entwicklungen sind T7 Stämme die nicht mehr über den (DE3) Genotyp verfügen, das heißt die T7 Polymerase unter Kontrolle des lacUV5 Promotors tragen, sondern unter wesentlich dichteren Promotorsystemen wie etwas dem Rhamnose- oder Arabinoseoperon. Bei diesem Stammen wird die T7 Polymerase erst nach Zugabe des entsprechenden Zuckers produziert. Das führt zu einer wesentlich geringeren Basaltanskription. Da diese Zucker im Vergleich zu IPTG relativ teuer sind, gelten solche Systeme allerdings nicht als wirtschaftlich bei der Produktion von kostengünstigen rekombinanten Produkten.

Ein zweites Problem bei der Verwendung des T7 Systems ist die starke Überexpression des „protein of intrest“. Die Folge hiervon ist ein hoher Produktverlust durch Inclusion Bodies.

Literatur

• Martin CT, Esposito EA, Theis K, Gong P: Structure and function in promoter escape by T7 RNA polymerase. In: Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 80. Jahrgang, 2005, S. 323–47, doi:10.1016/S0079-6603(05)80008-X, PMID 16164978. 
• Sousa R, Mukherjee S: T7 RNA polymerase. In: Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 73. Jahrgang, 2003, S. 1–41, doi:10.1016/S0079-6603(03)01001-8, PMID 12882513. 
• McAllister WT: Structure and function of the bacteriophage T7 RNA polymerase (or, the virtues of simplicity). In: Cell. Mol. Biol. Res. 39. Jahrgang, Nr. 4, 1993, S. 385–91, PMID 8312975. Sastry SS, Ross BM: Nuclease activity of T7 RNA polymerase and the heterogeneity of transcription elongation complexes. In: J. Biol. Chem. 272. Jahrgang, Nr. 13, März 1997, S. 8644–52, doi:10.1074/jbc.272.13.8644, PMID 9079696 (jbc.org). 
• Angewandte Mikrobiologie (German Edition)Garabed Antranikian (Editor) Publisher: Springer ISBN: 3540240837   Edition: Hardcover; 2005-09-21