Klonierung
Unter dem Begriff Klonierung wird in der Molekularbiologie eine Methode bezeichnet, bei der man eine beliebige DNA-Sequenz, z.B. das Insulin-Gen, in einen bakteriellen Vektor integriert. Diese Vektoren stammen von bakteriellen Plasmiden ab. Der Vektor mit der neu integrierten, zu untersuchenden DNA wird anschließend in einen Wirt transformiert und kann dann untersucht werden. Der typische Wirt ist ein Stamm des Bakteriums Escherichia coli .
Ziel einer Klonierung ist, das klonierte Gen zu vermehren, um es näher zu untersuchen oder um das entsprechende Protein rekombinant in großen Mengen herzustellen. Solche Proteine spielen eine Rolle
- für therapeutische Zwecke (z.B. Insulin etc.)
- in der Lebensmitteltechnologie (Lab-Ferment etc.)
Techniken
Beim Klonieren werden immer sogenannte Vektoren verwendet. Diese dienen als Transportvehikel zur Übertragung eines bestimmten DNA-Strangs in die DNA einer Empfängerzelle. Klonierungstechniken können unterschieden werden in solche, die in vivo (d.h. in einem Lebewesen oder einer lebendigen Zelle) stattfinden, und solche die in vitro (d.h. im Reagenzglas) stattfinden.
In vivo-Techniken
Verwendung von Plasmiden
Beim Klonieren mit Hilfe von Plasmiden werden aus Bakterien Plasmide gewonnen und mit Hilfe spezieller Restriktionsenzymen geschnitten. Die Ziel-DNA-Sequenz, die in einer PCR-Reaktion aus chromosomaler DNA hergestellt wurde und nun als Insert in den Vektor integriert werden soll, wird mit den gleichen Enzymen geschnitten, so dass komplementäre Ende an Vektor und Ziel-DNA entstehen (überstehende Einzelstränge, "sticky ends"). So ist es nun möglich, den Vektor und das Ziel-DNA-Stück miteinander zu verbinden. Dieser Vorgang, die Ligation, wird durch die T4-DNA-Ligase katalysiert.
Das Vektor-Insert-Konstrukt wird in spezielle E. coli-Stämme eingeführt, die chemisch- oder elektro-kompetent sind und damit zur Aufnahme der DNA in die Zelle optimiert sind. Hat ein Bakterium das Plasmid ins Zellinnere gebracht, so kann es mit Hilfe eines auf dem Plasmid vorhandenen Antibiotikum-Resistenzgens auf einer Agarplatte wachsen, die das Antibiotikum enthält. Durch Vermehrung des Bakteriums entstehen Bakterienkolonien (siehe Abbildung, links). Alle Bakterienzellen, die keinen Vektor tragen, gehen zugrunde (siehe Abbildung, rechts). Impft man mit einer solchen Kolonie ein Flüssigmedium an, so vermehren sich die Bakterien bei 37°C. Aus einem solchen Ansatz kann eine große Menge Plasmid-DNA gewonnen werden. Die DNA wird dann für weitere Klonierungen oder zur Proteinüberexpression eingesetzt.
Siehe auch
- Überexpression eines Proteins
- Entfernen eines Gens (Knock-out)
- Polymerase-Kettenreaktion
Klonen ist dagegen das Duplizieren der genetischen Information eines kompletten Organismus.