Polymerase-Kettenreaktion

Überblick

Die Polymerase-Kettenreaktion (kurz: PCR für engl. Polymerase Chain Reaction) ist eine Methode, um DNS zu vervielfältigen, ohne einen lebenden Organismus, wie z.B. E. coli oder Hefe zu benutzen. PCR wird in biologischen und medizinischen Laboratorien für eine Vielzahl verschiedener Aufgaben verwendet, zum Beispiel für die Erkennung von Erbkrankheiten, für das Erstellen und Überprüfen genetischer Fingerabdrücke, für das Klonieren von Genen und für Vaterschaft. Eine kompaktere Darstellung findet sich unter Polymerase-Kettenreaktion

Geschichte

Die Polymerase-Kettenreaktion wurde in den frühen 1980er Jahren von Kary B. Mullis entwickelt. Nur sieben Jahre nachdem er seine Idee veröffentlicht hatte, wurde Mullis hierfür der Nobelpreis für Chemie verliehen. Seine Idee war es, ein Verfahren zu entwickeln, das DNS durch wiederholte Verdoppelung in mehreren Zyklen mit Hilfe eines Enzyms namens DNS-Polymerase künstlich vervielfältigt.

DNS-Polymerase kommt in allen Lebewesen vor, sie verdoppelt die DNS vor der Zellteilung. Sie bindet an einen einzelnen DNS-Strang und erzeugt einen dazu komplementären Strang. In Mullis' ursprünglichem PCR-Versuch wurde das Enzym in vitro (in einer kontrollierten, künstlichen Umgebung) verwendet. Die doppelsträngige DNS wurde durch Erhitzen auf 96°C in zwei Einzelstränge aufgeteilt. Bei dieser Temperatur wurde die DNS-Polymerase zerstört und musste daher nach jedem Erhitzen erneuert werden. Mullis' ursprüngliches Verfahren war sehr ineffizient, da es viel Zeit, große Mengen DNS-Polymerase und ständige Aufmerksamkeit erforderte.

Später wurde der PCR-Prozess verbessert, indem man die DNS-Polymerase von thermophilen (Hitze liebenden) Bakterien verwendete, die bei über 110°C in Geysiren leben. Die DNS-Polymerase dieser Lebewesen ist thermostabil (stabil bei hohen Temperaturen) und wurde daher beim Erhitzen während der PCR-Zyklen nicht zerstört. Da nicht mehr ständig neue DNS-Polymerase hinzugefügt werden musste, konnte der der Vervielfältigungs-Vorgang erheblich vereinfacht und automatisiert werden.

Eine der ersten thermostabilen DNS-Polymerasen wurde aus Thermus aquaticus gewonnen und Taq genannt. Taq-Polymerase erfährt gegenwärtig (Mai 2001) breite Anwendung. Ein Nachteil der Taq-Polymerase liegt darin, dass sie manchmal Fehler beim Kopieren der DNS produziert, was zu Mutationen (Fehlern) in der DNS-Sequenz führt. Polymerasen wie Pwo oder Pfu, die aus Archaea gewonnen werden, haben einen Korrektur-Mechanismus, der die Anzahl der Mutationen in der kopierten DNS erheblich senkt.

PCR in der Praxis

PCR wird eingesetzt um einen kurzen, genau definierten Teil eines DNS-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens handeln. Im Gegensatz zu lebenden Organismen kann der PCR-Prozess nur kurze DNS-Abschnitte bis zu ca. 10 kbp (10.000 Basenpaare) kopieren. DNA ist doppelsträngig, und daher wird ihre Länge in komplementären DNA-Bausteinen (Nukleinsäuren) oder Basenpaaren gemessen. Mit Hilfe bestimmter Verfahren können Fragmente bis zu einer Länge von 40 kbp vervielfältigt werden, was immer noch sehr viel weniger ist als die chromosomale DNS einer eukaryotischen Zelle - eine menschliche Zelle enthält beispielsweise etwa drei Milliarden Basenpaare.

In ihren momentanen Anwendungsgebieten benötigt PCR mehrere grundlegende Komponenten. Diese sind:

Die Original-DNS, die den zu vervielfältigenden Abschnitt enthält
Zwei Primer, um Anfang und Ende des zu vervielfältigenden Abschnitts festzulegen (siehe auch den Abschnitt "Primer")
DNS-Polymerase, um den festgelegten Abschnitt zu kopieren
Nukleotide, die Bausteine für den von der DNS-Polymerase synthetisierten DNS-Strang
Puffer, die eine für die DNS-Polymerase geeignete chemische Umgebung sicherstellen

Die Polymerase-Kettenreaktion findet in einem so genannten Thermocycler statt. Diese Maschine erhitzt und kühlt die in ihr befindlichen Reaktionsgefäße präzise auf die Temperatur, die für den jeweiligen Schritt benötigt wird. Um Verdunstung zu verhindern, wird ein beheizbarer Deckel auf den Reaktionsgefäßen oder eine Ölschicht auf dem Reaktionsgemisch benutzt.

Primer

Das zu vervielfältigende DNS-Fragment wird durch die Primer ([Praim(e)r] nach engl. Primer - Startsubstanz) bestimmt. Primer sind kurze, künstlich erzeugte DNS-Stränge, die weniger als 50 Nukleotide lang sind (Da DNS normalerweise doppelsträngig ist, wird die Länge in Basenpaaren gemessen. Die Länge eines einzelnen DNS-Strangs wird in Basen oder Nukleotiden gemessen.) und exakt mit dem Anfang bzw. dem Ende des zu vervielfältigenden DNS-Teils übereinstimmen. An der Ausgangs-DNS lagern sie sich an den Start- und Endpunkten an, die von der DNS-Polymerase für die Synthetisierung des neuen DNS-Strangs benutzt werden.

Wie man die Länge und der Schmelzpunkt der Primer festlegt, hängt von einer Reihe von Faktoren ab. Der Schmelzpunkt eines Primers - nicht zu verwechseln mit dem Schmelzpunkt der DNS im ersten Schritt des PCR-Prozesses - bestimmt die Temperatur, unterhalb der sich der Primer an die Ausgangs-DNS anlagert. Wird der Schmelzpunkt überschritten, löst sich der Primer wieder von der Vorlage. Der Schmelzpunkt steigt mit zunehmender Primer-Länge. Sollte ein Primer zu kurz sein, kann er sich an verschiedenen Stellen der DNS anlagern, wodurch man den zu vervielfältigenden Bereich nicht mehr genau bestimmen könnte. Auf der anderen Seite ist die Länge des Primers durch die zum Erreichen des Schmelzpunkts benötigte Temperatur begrenzt. Ist der Schmelzpunkt zu hoch, d.h. über 80°C, kann das zu Problemen führen, da DNS-Polymerase bei solchen Temperaturen weniger aktiv ist. Die optimale Länge für den Primer liegt im Allgemeinen zwischen 30 und 40 Nukleotiden bei einem Schmelzpunkt zwischen 60°C und 75°C.

Ablauf

Der PCR-Prozess besteht aus einer Serie von 20 bis 30 Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten (Abb. 1). Zunächst wird die doppelsträngige DNS auf 96°C erhitzt um die Stränge zu trennen. Dieser Schritt wird Melting; (Schmelzen) genannt. Die Wasserstoff-Brückenbindungen, die die beiden DNS-Stränge zusammenhalten, werden aufgebrochen. Im ersten Zyklus wird die DNS oft für längere Zeit erhitzt um sicherzustellen, dass sich sowohl die Ausgangs-DNS als auch die Primer vollständig aufgetrennt haben und nur noch aus einem Strang bestehen.

Nach der Trennung der Stränge wird die Temperatur gesenkt, so dass die Primer sich an die einzelnen DNS-Stränge anlagern können. Dieser Schritt heißt Annealing (Anlagern). Die Temperatur während dieser Phase hängt von den Primern ab und liegt normalerweise 5°C unter ihrem Schmelzpunkt. Wird die Temperatur falsch gewählt, kann das dazu führen, dass die Primer sich nicht oder an der falschen Stelle an der Ausgangs-DNS anlagern.

Schließlich füllt die DNS-Polymerase die fehlenden Stränge. Sie beginnt am angelagerten Primer und folgt dann dem DNS-Strang. Dieser Schritt heißt Elongation (Verlängerung). Die Temperatur hängt nun von der DNS-Polymerase ab, die Zeit, die dieser Schritt benötigt, von der DNS-Polymerase und der Länge des DNS-Fragments, das vervielfältigt werden soll.

Datei:PCR-pcr.png

Abbildung 1: Schematische Darstellung des PCR-Zyklus. (Die Abbildung stammt vom Autor und wurde Nupedia zur Verfügung gestellt.)

Schmelzen bei 96°C.
Anlagerung bei 68°C.
Verlängerung bei 72°C (P=Polymerase).
Der erste Zyklus ist beendet.

Die beiden entstandenen DNS-Stränge bilden die Vorlage für den nächsten Durchlauf, die Menge an DNS verdoppelt sich also mit jedem neuen Zyklus.

Beispiel

Die angegebenen Zeiten und Temperaturen dieses Beispiels stammen aus einem PCR-Programm, das von Magnus Manske erfolgreich zur Vervielfältigung eines 250-bp-Fragment des C-terminalen Endes des insulinartigen Wachstumsfaktor (IGF) (engl. insulin-like growth factor) eingesetzt wurde.

Das Reaktionsgemisch besteht aus:

 1.0 µl DNS-Vorlage (100 ng/µl)
 2.5 µl Primer, 1.25 µl pro Primer (100 ng/µl)
 1.0 µl Pfu-Polymerase
 1.0 µl Nukleotiden
 5.0 µl Puffer
89.5 µl H2O

Ein 200 µl Reaktionsgefäß mit den 100 µl Gemisch wird in den Thermocycler gestellt.

Der PCR-Prozess besteht aus folgenden Schritten:

Schritt 1: Initialisierung. Das Gemisch wird 5 Minuten lang auf 96°C erhitzt, um sicherzustellen, dass die DNS-Stränge und Primer sich getrennt haben. Die DNS-Polymerase kann vor oder nach der Initialisierung zugefügt werden.

Schritt 2: Zerlegen. Die Temperatur 30 Sekunden lang auf 96°C halten. Das genügt gewöhnlich, um die DNS während den Zyklen zu zerlegen.

Schritt 3: Anlagerung. Die Temperatur 30 Sekunden lang auf 68°C halten.

Schritt 4: Verlängerung. Die Temperatur 45 Sekunden lang auf 72°C halten.
Die Schritte 2-4 werden 25 mal wiederholt.
Mit guten Primern und frischer Polymerase genügen 15 bis 20 Zyklen.

Schritt 5: Das Gemisch wird bei 7°C aufbewahrt. Es bietet sich an, die PCR am Abend vor dem Verlassen des Labors einzuleiten, so dass sie über Nacht laufen kann. Die DNS wird bei 7°C nach nur einer Nacht nicht beschädigt.

Das PCR-Produkt kann durch Agarose-Gelelektrophorese anhand seiner Größe identifiziert werden. (Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine Prozedur, bei der DNS in ein Agarose-Gel eingebracht wird und anschließend eine Spannung angelegt wird. Dann bewegen sich die kürzeren DNS-Stränge werden schneller als die längeren auf den Pluspol zu.) Die Menge des PCR-Produkts kann durch einen Vergleich mit DNS-Leiter, die DNS-Fragmente bekannter Größe (auch in Gel) enthält, bestimmt werden.

Datei:PCR-gel.png

Abbildung 2 : Das PCR-Product im Vergleich mit der DNS-Leiter in Agarose-Gel. (Das Bild wurde vom Autor erstellt und mit Genehmigung von Helmut W. Klein, Institut für Biochemie, Universität Köln, veröffentlicht)

DNS-Leiter (Bande 1), Das PCR-Product in niedriger Konzentration (Bande 2) und hoher Konzentration (Bande 3).

PCR-Anwendungsgebiete

Die PCR kann für eine Vielzahl von Experimenten und Analysen eingesetzt werden, einige Beispiele werden weiter unten vorgestellt.

Genetischer Fingerabdruck

Der genetische Fingerabdruck wird in der Gerichtsmedizin zur Identifikation einer Person eingesetzt, indem seine oder ihre DNS wird mit einer vorhandenen Probe verglichen wird. Beispielsweise kann eine Blutprobe von einem Verbrechensschauplatz mit dem Blut eines Verdächtigen verglichen werden. Die Probe muss nur geringe Mengen von DNS enthalten, die man aus Blut, Sperma, Speichel, Haaren oder ähnlichem gewinnen kann. Theoretisch genügt ein einziger Strang. Zuerst spaltet man die DNS-Probe in Fragmente auf, die dann mittels PCR vervielfältigt werden. Die vervielfältigten Fragmente werden anschließend durch Gelelektrophorese getrennt. Die so gewonnene Anordnung der DNS-Fragmente nennt man DNS-Fingerabdruck.

Vaterschaftstest

Obwohl diese erzeugten "Fingerabdrücke" einzigartig sind (außer bei eineiigen Zwillingen), können genetische Beziehungen, zum Beispiel zwischen Eltern und Kindern oder zwischen Geschwistern durch zwei oder mehr genetische Fingerabdrücke bestimmt werden, was bei Vaterschaftstests zum Einsatz kommt (Abb. 3). Eine Abwandlung dieser Technik wird auch zur Bestimmung evolutionärer Beziehungen zwischen Organismen angewandt.

Datei:PCR-fingerprint.png

Abbildung 3: Elektrophorese mittels PCR vervielfältigter DNS-Fragmente. (Die Abbildung stammt vom Autor und wurde Nupedia zur Verfügung gestellt.)) (1) Vater. (2) Kind. (3) Mutter. Das Kind hat Teile der Fingerabdrücke der beiden Elternteile geerbt wodurch es über einen eigenen, einzigartigen Fingerabdruck verfügt.

Erkennung von Erbkrankheiten

Die Erkennung von Erbkrankheiten in einem vorliegenden Genom ist ein langwieriger und komplizierter Vorgang, der durch den Einsatz von PCR bedeutend verkürzt werden kann. Jedes Gen, das in Frage kommt, kann durch PCR mit den entsprechenden Primern amplifiziert (= vervielfältigt) und anschließend sequenziert werden (DNS sequenzieren heißt, die Sequenz der Nukleotid (oder Basen) der DNS zu bestimmen) um Mutationen aufzuspüren.

Virale Erkrankungen können ebenfalls durch PCR erkannt werden, indem man die Virus-DNS vervielfältigt. Diese Analyse kann sofort nach der Infektion erfolgen, oft Tage oder Wochen vor dem Auftreten der Symptome. Erfolgt die Diagnose so früh, erleichtert das den Medizinern die Behandlung erheblich.

Klonierung von Genen

Das Klonieren eines Gens - nicht zu verwechseln mit dem Klonen eines ganzen Organismus - ist ein Vorgang, bei dem ein Gen aus einem Organismus isoliert und anschließend in einen anderen eingepflanzt wird. PCR wird oft benutzt, um das Gen zu vervielfältigen, das dann in einen Vektor (ein Vektor ist ein Mittel, mit dem ein Gen in einen Organismus verpflanzt werden kann), beispielsweise ein Plasmid (ein ringförmiges DNS-Molekül), einfügt wird (Abb. 4). Die DNS kann anschließend in einen anderen Organismus eingesetzt werden, in dem das Gen oder sein Produkt besser untersucht werden kann. Das Exprimieren eines klonierten Gens (ein Gen zu exprimieren heißt, das Protein herzustellen, dessen Bauplan das Gen darstellt) kann auch zur massenhaften Herstellung nutzbarer Proteine wie z.B. Arzneimittel dienen.

Datei:PCR-clone.png

Abbildung 4: Klonen eines Gens mit Hilfe eines Plasmids. (Die Abbildung stammt vom Autor und wurde Nupedia zur Verfügung gestellt.)

(1) Chromosomale DNS von Organismus A. 
(2) PCR. 
(3) Mehrere Kopien eines einzelnen Gens von Organismus A. 
(4) Einfügen des Gens in ein Plasmid. 
(5) Plasmid mit dem Gen aus Organismus A. 
(6) Insertion of the plasmid in organism B. 
(7) Vervielfältigung oder Expression des Gens, das aus Organismus A stammt, im Organismus B.

Mutagenese

Mutagenese ist eine Möglichkeit, die Sequenz der Nukleotide (Basen) der DNS zu verändern. Es gibt Situationen, in denen man mutierte (veränderte) Kopien eines bestimmten DNS-Strangs benötigt, um die Funktion eines Gens zur bestimmen oder zur in-vitro-Protein-Entwicklung. Mutationen könne in kopierte DNS-Sequenzen auf zwei grundsätzlich verschiedene Arten während des PCR-Prozess eingefügt werden. Gezielte Mutagenese erlaubt es dem Forscher, an spezifische Stellen auf dem DNS-Strang Mutationen zu erzeugen. Meist wird die gewünschte Mutation in die Primer integriert, die für die PCR verwendet werden. Zufällige Mutagenese beruht hingegen auf der Verwendung von fehlerträchtigen Polymerasen in dem PCR-Prozess. Bei der zufälligen Mutagenese können Ort und Art der Mutationen nicht beeinflusst werden. Eine Anwendung der zufälligen Mutagenese ist die Analyse der Struktur-Funktions-Beziehungen eines Proteins. Nach zufälliger Veränderung der DNS-Sequenz kann man das entstandene Protein mit dem Original vergleichen und die Funktion aller Teile des Proteins bestimmen.

Analyse alter (fossiler) DNS

In manchen Fossilien ist DNS noch in Bruchstücken vorhanden. Allerdings sind die Mengen, die direkt gewonnen werden können, meist sehr klein. Mittels der Klonierung der Fragmente durch PCR wird es möglich, DNS zu analysieren, die tausende von Jahren alt ist. PCR-Techniken wurden erfolgreich bei Tieren wie einem vierzigtausend Jahre alten Mammut eingesetzt, aber auch an menschlicher DNS, wobei die Anwendungen von der Untersuchung ägyptischer Mumien bis zur Identifizierung eines russischen Zars reichten. Die durch PCR vervielfältigte DNS wird sequenziert. Aus der Abfolge der Basenpaare im Vergleich zu anderen Sequenzen können dann Rückschlüsse auf die Verwandtschaft gezogen werden. Durch diese Methode wurden beispielsweise Hinweise darauf gewonnen, dass die heutige Menschenart Homo sapiens nicht aus dem Homo neanderthalensis hervorgegangen ist, obwohl beide zeitgleich in Europa existierten.

Siehe auch : Polymerase-Kettenreaktion (Kurzfassung), Nupedia Deutsch-L Sektion, Nupedia

Weiterführende Literatur:

Zu PCR (Polymerase-Kettenreaktion) :

Newton, C. R. and A. Graham. PCR: Introduction to Scientific Techniques. 2d. ed. Oxford: BIOS Scientific Publishers Ltd., 1997.
Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. "Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase." Science 239 (1988): 487-491.
United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction
PCR Project: Making PCR (Polymerase Chain Reaction) at University of California, Berkeley (http://sunsite.berkeley.edu/PCR/)

Zum Genetischen Fingerabdruck (Genetic Fingerprinting) :

Ballantyne, J., ed. DNA Technology and Forensic Science. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Billings, P. R., ed. DNA on Trial: Genetic Identification and Criminal Justice. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1992.
Saiki R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich, and N. Arnheim. "Enzymatic Amplification of Beta-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle-Cell Anemia." Science 230 (1985): 1350-1354.

Siehe auch : Polymerase-Kettenreaktion

Externe Webseiten

http://www.nupedia.com/article/678 -- Ursprüngliche Version des Artikels (auf Englisch)