In-situ-Hybridisierung
Die In situ-Hybridisierung ist ein Verfahren, um die mRNA in einem Gewebe sichtbar zu machen. Es werden bei einer solchen Färbung nur diejenigen Zellen angefärbt (hybridisiert), in denen das zu untersuchende Gen aktiv ist und in denen daher die mRNA im Cytoplasma vorliegt. Dieses Färbeverfahren findet besonders in der Entwicklungsbiologie Anwendung. Hier ist es von besonderem Interesse, die Aktivität eines Gens beispielesweise während der Embryogenese in situ zu verfolgen. Das embryonale Gewebe muss für die Färbung zunächst fixiert werden; die Aktivität kann daher nicht in Echtzeit verfolgt werden, sondern ist nur eine Momentaufnahme des Zustands, in dem sich das Gewebe befand, als es fixiert wurde.
Man unterscheidet RNA-in situ-Hybridisierung und DNA- in situ-Hybridisierung. Für erstere wird eine antisense RNA als markierte Sonde eingesetzt, für letztere eine zur mRNA komplementäre DNA. Das DNA- in situ-Hybridisierungsverfahren ist das ältere, wird aber heute nicht mehr so oft eingesetzt, da eine RNA-in situ-Hybridisierung etwas sensitiver ist.
Für die ersten In situ-Hybridisierungen wurden noch radioaktiv markierte Sonden eingesetzt, für die das Gewebe anschließend auf einen Röntgenfilm gelegt wurde. Dadurch konnte nur ein sehr ungenaues Bild der Genaktivität gewonnen werden. Heutzutage findet vor allem Digoxigenin- markierte RNA Verwendung. Das Digoxigenin kann mit Hilfe eines Antikörpers, der beispielsweise mit einem Enzym gekoppelt ist, erkannt werden. Das Enzym, meistens Alkalische Phosphatase oder Peroxidase, kann dann durch Zusatz von Reagenzien einen Farbstoff umsetzen, der kovalent im Gewebe gebunden bleibt und sich daher nicht durch Diffusion verteilt.
Ablauf einer In situ-Hybridisierung
Das zu färbende Gewebe- beispielsweise Embryonen von verschiedenen Modellorganismen wie Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Xenopus laevis, Mus musculus, Danio rerio - wird mit Hilfe von formaldehydhaltigen Lösungen fixiert. Anschließend wird es in einen formamidhaltigen Puffer überführt und die markierte Sonde dazugegeben. Die Hybridisierungszeit hängt von der Größe des Embryos ab und dauert mindestens einige Stunden. In dieser Zeit kann die Sonde durch das Gewebe diffundieren und bindet überall dort, wo sich komplementäre Sequenzen in der mRNA finden. Es folgen einige Waschschnitte, in denen überschüssige, nicht gebundene Sonde ausgewaschen wird, und am Schluss die Färbung, die dann mit einem Mikroskop genau analysiert und dokumentiert werden kann.
In der Abbildung rechts ist als Beispiel eine RNA-in situ-Hybridisierung an Embryonen (Eiern) von Drosophila melanogaster gezeigt. Die Digoxigenin-markierte antisense-RNA-Sonde ist gegen die mRNA des Transkriptionsfaktors hunchback gerichtet und wurde mit einer einfachen Färbereaktion mit Alkalischer Phosphatase sichtbar gemacht. Es ist deutlich erkennbar, dass sich das Expressionsmuster des Gens in den verschiedenen Entwicklungsstadien (St. steht abgekürzt für Stadium) verändert.
Neben Totalpräparaten, beispielsweise von Fliegenembryonen, kann die in situ-Hybridisierung an Gewebe-Dünnschnitten durchgeführt werden. Auf diese Weise können auch größere Präparate wie menschliches Gewebe oder komplette Mausembryonen untersucht werden. Die Abbildung links zeigt einen Mausembryo nach 14,5 (von insgesamt 20) Tagen der Schwangerschaft. Mit Hilfe der In situ-Hybridisierung wurde in einem 25 Mikrometer dünnen Gefrierschnitt die Aktivität des Gens Cannabinoid-Rezeptor Typ 1 (Cnr1) sichtbar gemacht, die als dunkelblaue Färbung unter anderem in verschiedenen Gehirnbereichen und im Rückenmark zu erkennen ist.
Literatur
- Leitsch AR, Schwarzache T, Jackson D, Leitsch IJ (1994): In situ-Hybridisierung, Spektrum Akademische Verlag Heidelberg, Berlin
Im Internet
- GenePaint.org (Datenbank für durch In situ-Hybridisierung untersuchte Gen-Expressionsmuster im Mausembryo)