Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
RT-PCR steht für Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion und ist die Kombination aus zwei Methoden der Molekularbiologie um die Genexpression von spezifischen Genen in Zellen, Geweben oder Blutserum nachzuweisen. Verwendet wird die RT-PCR in Forschung und Diagnostik.
Oft findet man auch für die Real time quantitative PCR die Abkürzung RT-PCR, was zu Verwechslungen führen kann.
Die Technik
Um die Transkription eines Genes nachzuweisen, muss die abgelesene RNA untersucht werden. Bei der Amplifikation von DNA mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden spezifische DNA-Polymerasen verwendet, welche DNA-abhängig sind, d.h. sie sind nicht in der Lage, RNA zu amplifizieren. Daher wird zuerst eine Reverse Transkriptase (RT) eingesetzt, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, mit deren Hilfe RNA in cDNA umgeschrieben werden kann. Die cDNA kann im Anschluss als Ausgangsprodukt in einer PCR verwendet werden, um spezifische Sequenzen aus dieser zu amplifizieren.
Die Produkte der RT-PCR lassen sich anschliessend klonieren und/oder elektrophoretisch in einem Agarosegel auftrennen. Verschieden große DNA-Fragmente wandern unterschiedlich schnell im Gel. Durch einen Fluoreszenzfarbstoff (meist Ethidiumbromid) können die Fragmente im UV-Licht sichtbar gemacht und dokumentiert werden.
Die heute eingesetzten Reverse Transkriptasen sind veränderte Enzymvarianten aus unterschiedlichen Retroviren, wie der „Moloney Murine Leukemia Virus“ (M-MLV RT) oder „Avian Myeloblastosis Virus“ (AMV RT). Die verschiedenen Varianten des Enzyms sind je nach Hersteller derart modifiziert worden, dass diese höhere Spezifität oder bessere Erträge generieren können, beispielsweise wird die im Enzym intrinsisch vorkommende RNase H-Aktivität deletiert.
Wie andere DNA-Polymerasen benötigt auch eine Reverse Transkriptase ein kurzes DNA-Stück, ein so genannter Primer, zur Initiation der DNA-Synthese. Oftmals wird hier ein so genannter Oligo-d(T)-Primers verwendet, also mehrere Thymin-Basen welche komplementär zum Poly(A)-Schwanz am 3'-Ende der mRNA sind. Erst im zweiten Schritt bei der PCR werden dann Gen-spezifische Primer eingesetzt. Bei einer modifizierten Variante, die "One-Step RT-PCR", wird statt dessen direkt Gen-spezifischen Primer verwendet und beide Reaktionen werden hintereinander im selben Gefäß ausgeführt. Eine weitere Variante der RT-PCR ist die RACE-PCR.
Die Abkürzung RT-PCR bezeichnet gelegentlich auch die Real time quantitative PCR, was zu Verwechslungen führen kann. Diese sollte mit RTQ-PCR abgekürzt werden.
Das Ergebnis
Da eine cDNA zur ursprünglichen mRNA komplementär ist, kann aus dieser an Hand des genetischen Codes auch die Aminosäurensequenz eines Proteins abgeleitet werden, für welche diese mRNA kodiert. Da eine mRNA in Eukaryoten nach ihrer Transkription bereits modifiziert und gespleißt wurde, ist sie im Gegensatz zum Gen auch Intron-frei. Darüber hinaus ermöglicht diese cDNA auch Informationen, ob dass dazugehörige Gen in verschiedenen Isoformen exprimiert wird, d.h. die mRNA alternativ gespleißt wird. Über RT-PCR lässt sich also gezielt Genexpression nachweisen. Genutzt wird die RT-PCR auch bei der Diagnose von RNA-Viren im Blutserum, wie HBV oder HIV und in jüngerer Zeit häufig auch im Zusammenhang mit Influenza A/H5N1.