Transfektion
Unter Transfektion versteht man das Einbringen von Fremd-DNA in Zellkulturzellen. Dabei unterscheidet man zwischen dem nur zeitweiligen Einbringen des Plasmids in die Wirtszelle (transiente Transfektion) und dem dauerhaften Einbau in das Genom (stabile Transfektion). Durch Abbauprozesse wird fremde DNA normalerweise schnell abgebaut, nach dem Einbau in die Wirts-DNA wird dieser Vorgang jedoch unterbunden.
Je nach Zellart eignen sich verschiedene Verfahren.
Chemische Verfahren
Im Prinzip handelt es sich hierbei um einen Spezialfall der Transformation, die jedoch als Methode eher in der Mikrobiologie Verwendung findet.
Kalzium-Phosphat-Präzipitation
Das am häufigsten verwendete Transfektionsverfahren ist die Kalzium-Phosphat-Präzipitation. In einem Gemisch aus Kalziumchlorid und Natriumphosphat bindet sich die zu übertragende DNA an ausfallendes Kalziumphosphat. Die ausgefallenen Kristalle werden der Zellkultur zugegeben und von den Zellen durch Endocytose aufgenommen. Der ganze Vorgang ist stark abhängig von der Wahl der richtigen Salzkonzentrationen und erfordert von Zellart zu Zellart experimentelles Geschick und Erfahrung.
Physikalische Verfahren
Mikroinjektion
Die Mikroinjektion ist ein technisch sehr aufwändiges Verfahren, bei dem die DNA als Plasmid, ssDNA (einzelsträngige DNA) oder dsDNA (doppelsträngige DNA) mit einer Injektionsapparatur direkt in den Zellkern bzw. in die Zelle injiziert wird. Dieses Verfahren ist sehr erfolgsversprechend, allerdings können immer nur wenige Zellen untersucht werden.
Schockgefrieren mit Glycerin
Die zu behandelnden Zellen werden bei -70°C schockgefroren und so für die DNA-Aufnahme „kompetent“ gemacht.
Elektroporation
Bei einer Elektroporation wird die Zellmembran durch Elektroschocks für DNS permeabel gemacht. Dieses Verfahren eignet sich nur für einige Zelltypen, da es bei diesem Verfahren zu Schäden innerhalb der Zelle kommen kann.
Zum Mechanismus: Da die Zellmembran eine Isolierung des elektrisch leitfähigen Cytoplasmas darstellt, kann elektrischer Strom so lange nicht durch die Zelle fließen, bis Poren in der Membran entstanden sind. Wird nun eine elektrische Spannung angelegt, so kommt es zur Polarisierung der Membran. Erreicht die transmembrane Spannung einen kritischen Wert von 0,4 bis 1 V, so kommt es durch eine lokale Zerstörung der Membranintegrität spontan zur drastischen Erhöhung ihrer Leitfähigkeit. Primär in der Membran entstandene hydrophoben Poren verwandeln sich bei Erreichen eines kritischen Radius spontan in relativ stabile hydrophile Poren (0,5-1 nm) mit einer Lebensdauer von wenigen Sekunden bis einigen Minuten. (nach Sukharev 1994)
Jüngere Forschungen an der Universität Lyon haben gezeigt, dass das Phänomen auch natürlicherweise vorkommt. So machen die elektrischen Entladungen bei Gewittern die Zellwände von im Boden lebenden Bakterien durchlässig, so dass fremde DNS aufgenommen werden kann. Diese Tatsache könnte eine wesentliche Rolle bei der beschleunigten Evolution von Mikroorganismen spielen.
Particle Gun
Bei diesem Verfahren wird die Fremd-DNA mit Hilfe von winzigen Metallkügelchen, auf denen die DNA fixiert wurde, in die Zelle geschossen. Es bietet sich für monokotyledone Pflanzen an, da diese ungeeignet sind für die Manipulation mit Agrobakterium tumefaciens.
Molekularbiologische Verfahren
Lipotransfektion
Genetisches Material wird mit Hilfe von Liposomen, Vesikeln die sehr leicht mit der Zellmembran fusionieren da beide von einer Phospholipiddoppelschicht (siehe Biomembran) umgeben sind, in die Zelle eingebracht.