Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), kurz auch EIA genannt, ist ein immunologisches Nachweisverfahren (Assay), welches im Gegensatz zum Radioimmunoassay (RIA) nicht auf einer Radioaktivitätsmessung, sondern auf einer enzymatischen Farbreaktion basiert.
Mit Hilfe des ELISA können verschiedenste biomolekulare Substanzen (z.B. Proteine, Viren) oder auch niedermolekulare Verbindungen (z.B Hormone, Toxine, Pestizide) in einer Probe (Blutserum, Milch, Urin, etc.) nachgewiesen werden. Hierbei macht man sich die Eigenschaft spezieller spezifischer Antikörper zu Nutze, die an den nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Die Antikörper oder teilweise auch das Antigen werden zuvor mit einem bestimmten Enzym markiert. Die von dem Enzym katalysierte Reaktion dient als Nachweis für das Vorhandensein des Antigens.
Sandwich-ELISA
Die klassische ELISA Technik (Sandwich-ELISA) verwendet zwei Antikörper (Ak), die beide hoch spezifisch an das nachzuweisende Antigen binden. Hierbei ist es wichtig, dass die beiden Aks an leicht unterschiedlicher Stelle an das Antigen binden, da sie sich sonst gegenseitig behindern. Der erste Antiköper (coating-Antikörper) wird an eine feste Phase (meist spezielle 96-Well-Mikrotiterplatte) gebunden. Die Probe mit dem nachzuweisenden Antigen wird dann in die wells gegeben und eine Zeit lang inkubiert. Während dieser Zeit fischt der an die Platte gebundene Antikörper das Antigen aus der Probe. Nach dieser Inkubationsphase wird die Platte gewaschen, was die ungebundenen Bestandteile der Probe entfernt und zurück bleibt nur das an den ersten (coating-) Antikörper gebundene Antigen. Im nächsten Schritt wird dann ein Detektions-(detection)-Antikörper zugegeben, der an seinem Ende ein Enzym (meistens Meerrettichperoxidase (HRP) oder Alkalische Phosphatase (AP)) gebunden hat. Dieser zweite Antikörper bindet ebenfalls an das Antigen und es entsteht ein Antiköper-Antigen-Antiköper Komplex (deshalb der Name Sandwich ELISA - das Antigen ist zwischen die beiden Antiköper wie in einem Sandwich gepackt)). Durch erneutes Waschen der Platte wird überschüssiger zweiter Antiköper weggewaschen und dann ein Farbsubstrat (z.B. para-Nitro-Phenyl-Phosphat (pNPP)) zugegeben. Im Falle von pNPP verwandelt das Enzym (z.B. AP) das zunächst farblose Substrat in ein gelbes Substrat. Die Stärke dieser Farbreaktion ist mittels eines Photometers messbar und ihre Intensität ist proportional zur Antigen Konzentration in der Probe. Bei höheren Konzentrationen in der Probe, oder bei längeren Zeiten der Farbreaktion entsteht eine sigmoidale Kurve, weil das Substrat der Farbreaktion zum größten Teil umgesetzt wird. Um die Konzentration des Antigens in der Probe quantitativ zu bestimmen wird neben der unbekannten Probe auch die Farbintensitaet in mehrerer Standardproben mit bekannter Konzentration des Antigens bestimmt und man erhält eine Standardkurve.
Kompetitiver Immunoassay
Häufig wird jedoch auch der kompetitive Immunoassay angewendet. Hierbei wird kein markierter Antikörper verwendet, sondern ein markiertes Kompetitor-Antigen (eine synthetische Verbindung, die dem Analyten strukturell ähnlich ist und auch am Antikörper bindet) eingesetzt. So kommt es zur Kompetition zwischen Analyt und Kompetitor um einen Bindungsplatz am Antikörper. Das Signal ist hier indirekt und nicht direkt proportional zur Analyt-Konzentration.
Auswertung des ELISAs mit Hilfe des Logit-Log-Plot
Eine sigmoide Kurvenform tritt dann auf, wenn man auf der x-Achse den natürlichen Logarithmus der Konzentration aufträgt, und auf der y-Achse die Extinktion (=OD=optische Dichte=Absorption). Diese Darstellungsform ist das halb-logarithmische Diagramm.
Um eine lineare Regression berechnen zu können, muss man diese Sigmoide vorher linearisieren. Zu diesem Zweck behält man die Dimension der x-Achse bei, und rechnet die y-Achse in Logit-Werte um. Dabei sollte eine gerade Linie entstehen. Diese Darstellungsform wird Log-Logit-Plot, Logit-Log-Plot oder auch Logit-Plot genannt.
Um Logit-Werte aus den Extinktionswerten berechnen zu können, muss man zuerst die Extinktionswerte (w) normalisieren (n), so dass sie einen Bereich von 0 bis 1 abdecken. Dazu benötigt man die untere (u) und die obere (o) Asymptote der sigmoiden Kurve.
Umkehrfunktion:
Diese normalisierten Extinktionswerte (n) gehen dann in die Logit-Gleichung ein (L):
Umkehrfunktion:
Die Wertepaare des Logit-Log-Plots aus dem x-Wert = natürlicher Logarithmus der Konzentration, und dem y-Wert = Logit der normalisierten Extinktionswerte (L) gehen dann in die Berechnung der linearen Regression ein. Diese liefert dann die Höhe (a) und die Steigung (b) der Geradengleichung:
Umkehrfunktion:
Für die Interpolation von unbekannten Messwerten auf die so erstellte Kalibrationskurve, fälschlich auch oft als Eichkurve bezeichnet, benötigt man dann die Umkehrfunktionen. Die höchste Genauigkeit wird in der Nähe des in der Mitte der Sigmoiden liegenden Wendepunktes erreicht, weil an dieser Stelle ihre Steigung am größten ist. Die geringste Genauigkeit entsteht in der Nähe ihrer Asymptoten.
Falls man aus mehreren unterschiedlichen Messwerten mit Hilfe der Asymptoten der Kalibrationskurve eine Messkurve errechnen kann, dann ist es am genauesten, wenn man die Wendepunktskonzentration der Kalibrationskurve mit der Wendepunktsverdünnung der Messkurve vergleicht. Die Asymptoten der Messkurven werden ignoriert, weil man alle Messergebnisse auf den Wendepunkt der Kalibrationskurve beziehen muss, der bei den y-Werten n = 0,5 im halblogarithmischen Diagramm, identisch mit L = 0 im Logit-Log-Plot, zu finden ist. Bei der halblogarithmischen Darstellung der Messkurve dient der natürliche Logarithmus des Kehrwertes der Verdünnung als x-Achse, weil bei den Messwerten die Konzentration vor der Berechnung noch unbekannt ist.
Grundsätzlich ist es auch möglich, an Stelle der natürlichen Logarithmen ln die dekadischen Logarithmen, oder jene mit der Basis von 2 zu verwenden, oder/und anstelle des Kehrwertes der Verdünnung nur die Verdünnung (Dilution) einzusetzen, oder/und den Wert von n als von 0 bis 100 Prozent gehend zu berechnen, sofern man die Gleichungen korrekt modifiziert. Nicht richtig wäre es aber, den Logit direkt aus den nicht normalisierten Extinktionswerten w zu berechnen.