Chromatographie

Chromatographie bzw. Chromatografie (griechisch, deutsch Farbenschreiben) wird in der Chemie ein Verfahren genannt, das die Auftrennung eines Stoffgemisches durch unterschiedliche Verteilung seiner Einzelbestandteile zwischen einer stationären und einer mobilen Phase erlaubt. Dieses Prinzip wurde erstmals 1903 von dem russischen Botaniker Michail S. Tswett angewendet und dargelegt. Er untersuchte einfarbige Pflanzenfarbstoffe und konnte diese durch Chromatographie in verschiedene Farbstoffe zerlegen. Praktische Anwendung findet diese Methode zum einen in der Produktion zur Isolierung bzw. Reinigung von Substanzen (= präparative Chromatographie), zum anderen in der chemischen Analytik, um Stoffgemische in möglichst einheitliche Inhaltstoffe zwecks Identifizierung oder mengenmäßiger Bestimmung aufzutrennen. Die Chromatographie ist aus der organischen Chemie, der Biochemie, der Mikrobiologie, der Lebensmittelchemie, der Umweltchemie und auch der anorganischen Chemie nicht mehr wegzudenken.

Beschreibung des Chromatographieprozesses

Datei:Chromatografie Dreieck mit analoger Entsprechung.png

Die Zusammenhänge in der Chromatografie und der entsprechende Vergleich

Die Chromatographie lässt sich am einfachsten durch einen Vergleich erklären:

Ein reißender Fluss kann einiges an Treibgut mit sich führen. Die Geschwindigkeit mit der das Treibgut weiterbewegt wird, hängt

von der Art des Treibguts (Sandkörner werden schneller als Kieselsteine transportiert)
von der Beschaffenheit des Flußbetts (raue Oberflächen erhöhen die Reibung des Treibguts und verringern somit die Geschwindigkeit des Abtransports)
und von der Wassermenge ab.

In der Chromatographie werden Substanzgemische (= Treibgut) in der sog. Mobilen Phase (= Wasser) auf einer Stationären Phase (= Flussbett) weiterbefördert. Auf Grund der Wechselwirkungen (siehe die Einteilung unter Trennprinzipien) zwischen der Probe, der stationärer Phase und der mobilen Phase werden die einzelnen Komponenten unterschiedlich schnell weitertransportiert.

Prozess

Datei:ChromatographieSchematisch.png

Schematische Darstellung

Für die Chromatographie sind die Herstellung des Flusses der Mobilen Phase, die Injektion der zu trennenden Probe, die eigentliche Trennung und die Detektion nötig. Das Fließen der Mobilen Phase wird entweder mittels einer hydraulischen Pumpe, der Kapillarkraft oder durch Anlegen einer elektrischen Spannung erreicht. Die Injektion (= Einbringen des Substanzgemisches in das chromatographische System) erfolgt entweder bevor der Fluss der Mobilen Phase hergestellt wird (z. B. Dünnschichtchromatographie) oder während die Mobile Phase bereits fließt. Bei einer großen Anzahl von Proben werden bei automatisierbaren Chromatographiearten sogenannte Autosampler (zusammen mit eigenen Datenerfassungssystemen) eingesetzt, die vollautomatisch die Proben injizieren. Anschließend erfolgt die eigentliche Auftrennung des Substanzgemisches auf der Trennstrecke. Ohne Detektion (= Sichtbar machen, wann eine Substanz einen bestimmten Teil des Chromatographiesystems passiert oder wo eine Substanz nach dem Beenden des Prozesses zum Liegen kommt) ist eine Chromatographie nicht denkbar. Für jede Chromatographieart werden verschiedene Detektionsysteme eingesetzt, indem entweder physikalische Eigenschaften (Absorption von Licht, Fluoreszenz, Lichtstreuung, Wärmeleitfähigkeit ..) der Substanzen ausgenutzt werden oder durch chemische Reaktionen ein Signal erhalten wird. Mittels chemischer Reaktionen wird z.B. eine Färbung bei der planaren Chromatographie erreicht (z.B. Aminosäuren mittels Ninhydrin) oder Reaktionen vor dem Auftrennen (Vorsäulenderivatisierung) oder nach dem Auftrennen (Nachsäulenderivatisierung) bei der Säulenchromatographie durchgeführt. Bei der präparativen Chromatographie wird anschließend noch ein Fraktionensammler zum Auffangen der aufgetrennten Substanz benötigt.

Definition einiger Begriffe

Stationäre Phase

Phase, die mit den einzelnen Substanzen des Substanzgemisches in Wechselwirkungen eingeht und sich nicht bewegt.

Mobile Phase

Phase, in der das Substanzgemisch zu Beginn gelöst ist und die sich dann bewegt (Phase an einem festen oder flüssigen Stoff). Mobile Phasen unterscheiden sich in ihrer Elutionsfähigkeit ("Stärke" s. u. "[Elutrope Reihe]"), dies bedingt unterschiedliche Selektivitäten.

Retention

Verzögerung von einzelnen Substanzen des Substanzgemisches durch Wechselwirkung mit der stationären Phase.

Retentionszeit

Zeit, die eine Substanz benötigt, um die gesamte Trennstrecke zu passieren.

Elution

Transport einer Substanz durch eine chromatographische Säule durch kontinuierliche Zugabe von mobiler Phase. Eine besondere Bedeutung hat dieser Prozess in der Festphasenextraktion.

Eluat

Mobile Phase, die die Trennstrecke passiert hat.

Eluotrope Reihe

Anordnung der als mobile Phase üblichen Lösungsmittel nach ihrer Elutionskraft bei einer Referenzsubstanz (i.d.R. Kieselgel oder Aluminiumoxid). Die Anordnung kann aufsteigend oder absteigend gewählt werden.

Säule

In der Chromatographie versteht man unter einer Säule eine hohle Röhre von einem Durchmesser von wenigen Mikrometern bis zu mehreren Zentimetern. Diese Röhre ist entweder mit der stationären Phase gefüllt oder innen beschichtet.

Die chromatographischen Trennmethoden lassen sich nach verschiedenen Gesichtspunkten einteilen:

Einteilung nach dem Trennprinzip

Das grundlegende Prinzip aller chromatographischen Verfahren ist die oft wiederholte Einstellung eines Gleichgewichtes zwischen einer ruhenden Phase und einer bewegten Phase. Das Gleichgewicht kann sich auf Grund verschiedener physikalisch-chemischer Effekte ausbilden.

Adsorptions-Chromatographie - Hier kommt es zu einer Trennung der verschiedenen Komponenten auf Grund der unterschiedlich starken adsorptiven Bindungen zur ruhenden Phase. Die bewegte Phase kann ein mehr oder weniger polares Lösungsmittel oder bei gasförmigen Stoffen ein Trägergas sein.
Verteilungs-Chromatographie - Ähnlich dem Extraktionsverfahren wird hier die unterschiedliche Löslichkeit der zu trennenden Komponenten ausgenutzt. Bei der Chromatographie bleibt aber das Lösungsmittel als ruhende Phase auf einem Trägermaterial haften. Die bewegte Phase kann wieder eine Lösung oder ein Trägergas sein.
Ionenaustauschchromatografie (siehe auch Anionenaustauschchromatografie und Kationenaustauschchromatografie) - Die bewegte Phase ist hier meist eine Lösung der zu trennenden Ionen. Die ruhende Phase ist ein fester Ionenaustauscher. Ionenaustauscher bilden zwischen den verschiedenen Ionen der bewegten Phase unterschiedlich stabile Bindungen aus.
Siebwirkung - Bei der ruhenden Phase benutzt man Stoffe, die die Komponenten an Hand ihrer Größe trennen. Im Wesentlichen unterscheidet man hier zwischen drei Verfahren.
- Molekularsieb-Chromatographie
- Gel-Permeations-Chromatographie (Gelfiltration)
- Ausschluss-Chromatographie
Affinitätschromatographie - Als stationäre Phase wird eine für jeden Analyten spezifische chemische Verbindung eingesetzt die auf Grund nichtkovalenter Kräfte eine Trennung bewirkt. Es handelt sich hierbei um eine hochselektive Methode.
- IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) wird speziell für Proteine eingesetzt.
Chirale Chromatographie - Zur Trennung von chiralen Molekülen. Die stationäre Phase enthält ein Enantiomer, das mit den beiden Enantiomeren des Racemats eine unterschiedlich starke diastereomere Wechselwirkung eingeht. Die beiden Enantiomere werden unterschiedlich stark retardiert.

Einteilung nach den verwendeten Phasen

Auf Grund der mobilen Phasen kann man die Chromatographie in drei Gebiete unterteilen, welche sich nach den Trägern der stationären Phasen oder dem Aggregatzustand der stationären Phasen wieder in unterschiedlich viele Gruppen unterteilen lassen.

Flüssigchromatographie (engl. liquid Chromatography, LC)
- Planare Chromatographie
  - Papierchromatographie - Als feste Phase wird Papier verwendet, das entwender liegt oder (meist) senkrecht in einem Glasbehälter steht. Wie auch bei der Dünnschichtchromatographie wird die Mobile Phase auf Grund der Kapillarkräfte bewegt.
  - Dünnschichtchromatographie - Als feste Phase werden z.B. Silikapartikel auf einer Glas- oder Kunststoffplatte aufgetragen.
- Säulenchromatographie
  - Niederdruckchromatographie - Die hier verwendeten Säulen weisen Durchmesser von einem bis vielen Zentimetern auf. Diese Form der Flüssigchromatographie wird vor allem für präparative Trennungen eingesetzt.
  - Hochleistungschromatographie (früher Hochdruckchromatographie; engl. HPLC High Performance Liquid Chromatography) -Stellt die heute am weitesten verbreitetste in der Analytik eingesetzte Trennmethode dar. Die mobile Phase wird mit Drücken bis zu 400 bar und Flussraten bis zu 5 ml/min bewegt.
  - Elektrochromatographie - In diesem Fall wird die Mobile Phase durch Anlegen einer Spannung bewegt. Diese Methode befindet sich noch im Entwicklungsstadium und wird im Routinebetrieb nicht angewendet. Nicht zu verwechseln mit Elektrophorese.
- Membranchromatographie
  - Hierbei wird statt einer mit chromatografischer Matrix gefüllten Säule eine ein- oder mehrlagige Membran als feste Phase in einem entsprechenden Gehäuse eingesetzt. Die mobile Phase wird bei niedrigen Drücken bis zu 6 bar und bei etwa 20-fach höheren Flußraten als in der Säulenchromatographie üblich durch die Membran gepumpt.
Gaschromatographie
- Gepackte Säulen - Das innere einer Säule (lange Röhre) ist mit einem feinkörnigem Material gefüllt.
- Kapillarsäulen - Nur die Säulenwand ist mit einer dünnen Schicht aus Stationärer Phase bedeckt.
  - Flüssige stationäre Phase
  - Feste stationäre Phase
Überkritische Fluidchromatographie (engl. SFC supercritical fluid chromatography) - Als mobile Phase wird eine Substanz in ihrer überkritischen Phase (Zustand zwischen Gas und Flüssigkeit eingesetzt). Hierbei handelt es sich meist um Kohlendioxid. Bei dieser Methode werden nur Säulen als Träger von stationären Phasen eingesetzt.

Kenngrößen der Chromatographie

Der Trennfaktor α gibt die Güte der Trennung zweier Substanzen an. Er beruht auf der Retentionszeiten $t_{R}$ der Komponenten in der Säule. Die Retentionszeit ist die Zeit, die die betrachtete Komponente zum Durchqueren der Säule braucht und wird am Peakmaximum abgetragen:

$\alpha ={\frac {k_{2}}{k_{1}}}$

mit dem Retentionsfaktor $k$ definiert durch:

$k={\frac {t_{R}-t_{0}}{t_{0}}}$

$t_{0}$ nennt man die Durchflußzeit der Säule. Die Durchflußzeit ist die Zeit, die das Lösungsmittel bzw. das Trägergas zum Durchqueren der Säule braucht. Früher war der Begriff Totzeit gebräuchlich, sollte aber aus Irritationsgründen nicht mehr gebraucht werden.

$u$ nennt man die lineare Durchflußgeschwindigkeit der mobilen Phase durch die Säule, sie ist definiert als:

 $u={\frac {L}{t_{0}}}$

wobei L die Länge der Säule ist.

$R$ , die Auflösung zweier Peaks errechnet sich aus:

$R=2*({\frac {t_{R2}-t_{R1}}{b_{B2}+b_{B1}}})$ oder $R=1,198*({\frac {t_{R2}-t_{R1}}{FWHM_{1}+FWHM_{2}}})$

$N$ , die Bodenzahl beschreibt die Anzahl der Gleichgewichtseinstellungen, der zu trennenden Substanz zwischen stationärer und mobiler Phase, in der Säule. Je größer N, desto mehr Gleichgewichtseinstellungen können in einer bestimmten Länge erfolgen, woraus eine bessere Trennleistung der Säule resultiert. N wird berechnet mit Hilfe der Formel:

$N=16*({\frac {t_{R}}{b_{B}}})^{2}$ oder $N=5,54*({\frac {t_{R}}{FWHM}})^{2}$

$b_{B}$ : Basislinienbreite

$FWHM$ : "Full Width at Half Maximum" Fwhm

$n$ : Peakkapazität; Gibt an, wieviele Peaks innerhalb eines Intervalls zwischen $t_{0}$ und dem k-Wert eines bestimmten Peaks theoretisch mit einer Auflösung von R=1 voneinander getrennt werden können.

$n=1+{\frac {\sqrt {N}}{4}}*\ln(1+k_{max})$

$H$ bezeichnet die Trennstufenhöhe eines theoretischen Bodens (HEPT) und ist das Verhältnis zwischen Säulenlänge und Bodenzahl:

$H={\frac {L}{N}}$

Praktische Werte liegen im Bereich von 0,1 bis 0,5 mm.

Trennstufenhöhe H

Die Trennstufenhöhe einer chromatografischen Säule ist ein Maß für die Trennleistung der Säule. Als Trennstufe kann man sich den gedachten Abschnitt der Trennsäule, auf dem sich das chromatographische Gleichgewicht einmal einstellt, vorstellen. Je mehr solche Gleichgewichtseinstellungen "auf der Säule Platz haben" umso geringer ist die Trennstufenhöhe und umso höher ist die Trennleistung der Säule. Zur Erlangung einer niedrigen Trennstufenhöhe sind unter analytischen Bedingungen folgende Voraussetzungen nötig:

Es wird eine rasche Gleichgewichtseinstellung der Absorption oder Verteilung erwartet. Daher sollte der Teilchendurchmesser d so klein wie möglich sein.
Konstante Temperatur in der gesamten Säule. Dazu kann ein Säulenthermostat benutzt werden.
Konstante Fließgeschwindigkeit: Hierfür wird eine Kolbenpumpe mit bis zu 400 bar verwendet.
Linearer Absorptionsbereich: Die stationäre Phase sollte im Verlauf der Chromatographie nicht überladen werden.
Vernachlässigbare Diffusion wäre wünschenswert, ist experimentell aber leider nicht erreichbar. Es werden daher möglichst regelmäßige Packungen mit Teilchen von besonders kleinem Durchmesser verwendet.

Zur Ermittlung der Trennstufenhöhe in Abhängigkeit von der Fließgeschwindigkeit des Eluenten kann die sog. Van-Deemter-Gleichung für die HPLC herangezogen werden:

 $H=A+{B \over u_{x}}+C\cdot u_{x}$

wobei:

$H$ die Trennstufenhöhe,
$u_{x}$ die lineare Fließgeschwindigkeit ist.
$A$ -Term berücksichtigt die Eddy-Diffusion die durch unterschiedliche Fließstrecken durch die Packung entsteht. Es gilt: $A=2\cdot p\cdot d$ $A=2\cdot p\cdot d$ wobei
- $p$ den Packungsfaktor,
- $d$ den Teilchendurchmesser bezeichnet.
Der $B$ -Term berücksichtigt die longitunale Diffusion. Die longitunale Diffusion ist die Diffusion der Analytenmoleküle in beide Richtungen der Trennstufe. Es gilt: $B=2\cdot D\cdot L$ $B=2\cdot D\cdot L$ wobei:
- $D$ die Diffusionskonstante in der mobilen Phase und
- $L$ der Labyrinthfaktor ist. Der Labyrinthfaktor berücksichtigt die Porenstruktur der stationären Phase.
der $C$ -Term berücksichtigt die Peakverbreiterung durch die langsame Gleichgewichtseinstellung zwischen der mobilen und der stationären Phase. Hierbei ist noch die Diffusionskonstante $D_{s}$ entlang der Poren der stationären Phase zu beachten. Es gilt damit:

 $C={{t_{s} \over t_{m}} \over (1+{t_{s} \over t_{m}})^{2}}\cdot {d^{2} \over D_{s}}$

Peaksymmetrie

Die Peaksymmetrie ist ein Maß für die Güte einer Analyse. Solche Angaben werden vor allem bei Qualitätskontrollen im pharmazeutischen Bereich gefordert. Für die Peaksymmetrie gibt es zwei verschiedene Definitionen, wobei für beide gilt: Je näher der Wert eins erreicht wird, desto besser war die Analyse.

Peaksymmetrie T (oder auch $A_{s}$ ), wird hauptsächlich in Europa verwendet.

Peaksymmetrie

Peak Tailing Factor PTF, wird hauptsächlich in den USA verwendet.

Peaktailingfactor

Praktisches Experiment

Chromatographie kann man mit handelsüblichen Mitteln zu Hause durchführen. Man benötigt:

1 Kaffeefilter, möglichst weiß,
einige Buntstifte

Auf den unteren Rand des Kaffeefilters malt man einen oder mehrere bunte Punkte, stellt das Papier in eine Schale mit Wasser, so dass sich das Papier mit Wasser vollsaugt.

Da die Farbe der Buntstifte wasserlöslich ist, transportiert das Wasser nun die Farbe nach oben.

Unser, sagen wir mal, roter Bunstift ist nun aber eigentlich nicht rot. In Wirklichkeit besteht er aus einem Gemisch unterschiedlicher Farben, die zusammen rot aussehen. In unserem Experiment gehen die unterschiedlichen Farbenpigmente nun mit dem Papier eine unterschiedlich starke Wechselwirkung ein und werden dadurch vom Wasser mehr oder weniger schnell transportiert.

Daher können wir bald mehrere, verschiedenfarbige Flecken erkennen.

Wir haben soeben die Buntstiftfarben chromatographisch getrennt.

Siehe auch

Weblinks