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Extremitätenentwicklung

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Extremitätenentwicklung in Tetrapoden — Landwirbeltiere mit vier Extremitäten — will die progressive Formbildung der skelletären Muster entlang dreier Achsen der Gliedmaßen erklären. Die Extremitätenentwicklung ist ein Bereich aktiver Forschung in der Entwicklungsbiologie.

Embryonale Entwicklungsphasen der Hand bei der Maus, von etwa 10. bis 14. Tag nach Befruchtung

Übersicht über den Gesamtprozess

Wichtige Komponenten und Achsen in der Extremitätenknospe der Maus

Die beginnende Ausbildung der Extremität erfolgt im Extremitätenfeld. Das Extremitätenfeld ist eine Region, die durch die Expression bestimmter Hoxgene (Homöobox) und Tbx-Gene gekennzeichnet ist, (Tbx5 für die vordere und Tbx4 für die hintere Extremität). Die Extremitätenentwicklung beginnt somit in der linken und rechten Flanke des Embryos, wenn noch nicht differenziertes, uniformes mesenchymes Zellgewebe des lateralen Mesoderm aus den Somiten auswächst und sich das oberhalb liegende Ektoderm zur Extremitätenknospe ausstülpt. Mehrere Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) induzieren die Ausbildung eines Organisators, der apikalen ektodermalen Randleiste (AER), die das weitere Wachstum steuert. Zellen in der Knospe kondensieren zunächst, differenzieren dann in Knorpelgewebe und formen schließlich genetisch und epigenetisch Muster, die später die Knochen von Stylopod, Zeugopod und Autopod bilden. Die exakte Ortsbestimmung und Formfindung dieser diskreten, skelettären Elemente innerhalb der sich entwickelnden Knospe sind der eigentliche Gegenstand der Forschung.

Entwicklungsphasen des Flügels beim Hühnchen. rosa: Mesechymes Gewebe, hellblau: Knorpelgewebe: blau: Knochen

Im folgenden werden in diesem Artikel bekannte Modelle skizziert, die seit dem Ende der 1960er Jahre entstanden sind und molekulare Einblicke zunächst in die Entwicklung des Hühnchenflügels und später auch in die vordere Extremität der Maus lieferten. Zwischen den Modellen herrschten heftige Kontroversen über die Geninteraktionen, die bis heute andauern. Nach mehr als 50 Jahren der Forschung ist nicht geklärt, in welcher Form Zellen Positionsinformationen erhalten können, die ihnen erlaubt, an exakt zu bestimmenden Stellen in Knorpelgewebe zu differenzieren und damit die Musterbildung der Wirbeltierextremität zu ermöglichen. Es ist nicht einmal klar, ob es solche Positionsinformationen überhaupt gibt. Neuere Computersimulationsmodelle, die auf Zellebene und nicht auf genetischer Ebene operieren, arbeiten ohne Positionsinformationen und statt dessen auf Turing-basierten Musterbildungsprozessen der Komplexitätstheorie. Die Herausforderungen liegen demnach heute in der Integration molekularer Modelle mit epigenetischer (zellularer) Musterbildung auf der Basis von Computersimulationen [1]

Begriffe (Phänotyp)

AER - Apikale ektodermale Randleiste. Organisatorregion (Signalzentrum) für die Steuerung des proximo-distalen und antero-poesterioren Auswuches der Knospe
ZPA - Zone polarisierender Aktivität. Organisatorregion maßgebend für die Musterbildung der Finger bzw. Zehen

Wichtige phänotypische Begriffe zum Verständnis der Extremität und ihrer Entwicklung am Beispiel der menschlichen Hand sind:

• Oberarm (Stylopod)

• Elle (Ulna) und Speiche (Radius) = (Zeugopod)

• Hand (Carpals und Metacarpals)) mit Fingern (digits) = (Autopod)

• AER Apikale Ektoderm Randleiste: Organisatorregion (Signalzentrum)für proximal-distale Ausbildung der Extremitätenknospe

• ZPA Zone polarisierender Aktivität: Organisatorregion am posterioren Ende der Extremität; verantwortlich für die anterior-posteriore Achsenbildung. Beeinflusst maßgeblich Anzahl und Identität von Fingern.

• Morphogen: diffusibles Molekül, bildet einen Konzentrationsgradienten und erwirkt eindeutige Zellantworten bei unterschiedlichen Konzentrationen.

Dauer der Extremitäten-Skelettbildung

Die Entwicklung der Extremitäten (Flügel und Beine) beim Hühnchen dauert ca. vom dritten bis sechsten Tag bei eier Gesamtentwicklungszeit von 21 Tagen. Bei der Maus beginnt die Ausstülpung der Knospe nach ca. 9.5 Tagen; die Knochenbildung der Extremitäten ist nach vier Tagen etwa Mitte des 13. Entwicklungstages abgeschlossen bei einer Gesamtentwicklungszeit von ebenfalls ca. 21 Tagen. Beim Mensch verläuft die Gliedmaßenentwicklung während ab der fünften Schwangerschaftswoche. In der achten Woche sind Arme, Beine, Hände und Füße ausgebildet, die Apopthose zur Trennung der Finger und Zehen ist noch nicht vollzogen. Der menschliche Embryo hat eine Gesamtlänge von ca. 18 mm. Die Apopthose erfolgt in der neunten Woche.

Periodizität der Extremitätenmuster

Die Extremität wird proximal nach distal in drei Regionen gegliedert: Stylopod, Zeugopd uand Autopod. In distaler Richtung erfolgt eine Verdoppelung bzw. Vervielfachung der Knochen. Der Stylopod besteht aus zwei Knochen: Ulna und Radius, der Autopod aus drei (Hühnchen-Flügel) bis fünf Elementen (Maus) entlang antero-posterioren Achse. Finger und Zehen zeigen ebenfalls quasi-periodische Muster in Form der tandemartig angelegten Glieder entlang der proximo-distalen Achse. Die Elemente auf gleicher Höhe der proximo-distalen Achse haben unterschiedliche Identitäten, so Ulna und Radius, aber auch die einzelnen Finger bzw. Zehen.

Kondensation und Chondrogenese

(wird nachgeliefert)

Axiale Muster

Folgende Hauptachsen werden in der Extremität unterschieden:

• Proximo-distale Achse: Von Schulter zur Fingerspitze

• Anterior-posteriore Achse: Vom fünften Finger zum Daumen

• Dorso-ventrale Achse: Von Handinnen- zur Außenseite

Genetische Modelle

Die klassischen Modelle der Extremitätenentwicklung und ihre Nachfolgersysteme gehen bei der Lösung des Problems der Musterbildung von Genen und kombinatorischen Genexpressionen aus. Die Formbildung soll somit auf der untersten biologischen Organisationsebe erklärt werden.

Morphogen-Gradienten-Modell (French flag model) nach Wolpert 1969

French flag model nach Wolpert.

Das MGM wurde von Lewis Wolpert 1969 vorgeschlagen als Modell für die Extremitätenentwicklung beim Hühnchen [2]. Wolpert postulierte, dass die vom ZPA-Ursprungsort segregierte, in fortschreitender Expressionsrichtung entlang der AP-Achse räumlich abnehmende Konzentration eines damals noch nicht bekannten Morphogens für das Schicksal der Zellen in Reichweite dieses Morphogens und damit für die Fingerbausbildung verantwortlich ist.

Das Morphogen bildet einen Verlaufsgradienten aus und liefert auf diesem Weg die Positionsinformationen für die Zellen, damit diese an exakt bestimmten Stellen in Knorpelgewebe differenzieren können und damit die Musterbildung der Finger bzw. Zehen erfolgt. Später wurde das diffusionsfähige Protein Sonic Hedgehog (SHH) als das wahrscheinliche Morphogen identifiziert. Bei der SHH-Funktionsweise in der Extremitätenentwicklung hat Wolpert später angenommen, dass die abnehmende SHH-Konzentration mit Schwellenwerteffekten, also als diskrete Abstufungen, interpretiert wird. Solche Schwellenwertlevels hat er blau-weiß-rot gekennzeichnet, was dem Modell auch den Namen French flag model einbrachte. Die Erklärung der Wirkungsweise des Morphogens erfolgte durch Wolpert zunächst über die räumliche Konzentration, wurde aber später auch über die zeitliche Konzentration von SHH in Richtung der AP-Achse erweitert [3], wodurch allerdings das Ursprungsmodell von Wolpert abgeändert wurde (Zuniga und Galli 2006,88) Der Verlaufsgradient wirkt in einer Weise, die bis heute nicht geklärt ist, auf die Zellen ein. Sie können, so die Theorie, dessen Konzentration und Dauer als Positionswerte interpretieren, molekular enkodieren und schließlich in die erforderliche Finger-Anatomie übersetzen [4].

Progressionszonen-Modell (Clock face model) nach Summerbell 1976

Das klassische Progressionzonen-Modell, auch Clock Face Model genannt, wurde 1976 als Gegenmodell zum Morphogen-Gradienten-Modell eingeführt. Es will die spezifische Zell- und Gewebebildung damit erklären, dass mit fortschreitender Proliferation der Knospe entlang der proximo-distalen Achse durch die AER Zellen in der angrenzenden Wachstumszone zunächst „neutral“ gehalten werden, also nicht oder noch nicht diversifizieren. Je nachdem ob Zellen kürzer oder länger in der Wachstumszone verbleiben bis sie diese verlassen, wird über ihr Schicksal entschieden: Je später Zellen die Wachstumsphase verlassen, desto distalere Strukturen entstehen aus ihnen. Bestätigt wird dieses Modell durch Entfernen der AER in einer frühen Phase, was zum Wegbleiben weiter Teile des Stylopod und Zeugopods führt, also nur einen Stumpf des Arms formt, während bei ihrem Entfernen in einer späten Phase der Knospenentwicklung die genannten Teile ausgebildet werden, jedoch nicht der Autopod und damit nicht die Finger. Den Wirkungsmechanismus zur Erzeugung der proximo-distalen Strukturen will das Progessionszonen-Modell mit der Autonomie der noch undifferenzierten Zellen in der Progessionszone erklären. Diesen Zellen wird die Eigenschaft einer inneren Uhr zugesagt, die unter anhaltendem Einfluss der AER über ihr weiteres Schicksal bestimmen kann.

Computersimulation der sich entwicklenden vorderen Extremität der Maus nach dem Progressionzonen-Modell; schwarz: Mesenchymgewebe; blau (rechts): AER; grün: Progressionszone; rot: Knorpel- und Knochengewebe

Das Progessionszonen-Modell ist jüngst in Frage gestellt worden durch zwei Studien, die den Zellen besagte Autonomie absprechen, jedenfalls die Autonomie zur Erzeugung der proximo-distalen Struktur[5],[6]. Die Autoren, die unabhängig zu vergleichbaren empirischen Ergebnissen kamen, erklären das Fortschreiten der proximo-distalen Struktur nicht mit Zellautonomie sondern mit gegenläufigen Zellsignalen, der proximalen Retinsäure (RA), die in der Knospe in distaler Richtung sendet sowie distaler FGF-Aktivität, die ausgehend von der AER in umgekehrter Richtung wirkt. Es entsteht nach den Autoren ein dynamisches Gleichgewicht zwischen diesen Signalen. Dieses steuert unter Mitwirkung entsprechender Hoxgene die proximo-distale Ausbildung, des Zeugopods und des Stylopods. Dabei gelang den Forschern, z.B. angestrebte distale Strukturen in vivo zu erzeugen, in dem sie proximales Gewebe an Orte rekombinant transplantierten, die keiner RA-Expression ausgesetzt waren. Umgekehrt konnte eine vollständige Proximo-distalen Achse mit distalem Gewebe in vitro erzeugt werden, indem die kultivierten Zellen exogenem RA-Einfluss ausgesetzt wurden, der die distalen Signale übersteuerte.

Early specification model nach Dudley 2002

Die Forschung hat sich im vergangenen Jahrzehnt parallel verstärkt der Frage zugewandt, ob die Positionsbestimmung der Koordinaten im Verlauf der Knospenentwicklung eher früher oder eher erst später erfolgt. Nach dem Progressionszonen-Modell ist zu schließen, dass in einem frühen Stadium der Knospe lediglich die proximalen Positionen bestimmt sind, während – entsprechend dem längeren Verbleib von Zellen in der Wachstumszone – erst gegen Ende der Knospenbildung die Positionen für die distalen Elemente bestimmt werden können. Das wird im Eearly specification model anders gesehen. Danach liegen alle Positionen, z.B. die Fingerspitzen, bereits bei Beginn der Knospenbildung fest. Im Verlauf des Wachstums der Knospe entlang der proximo-distalen Achse expandieren dann die mehr proximalen, also körpernahen Koordinaten, während die mehr distalen Punkte noch länger „eng gepackt“ verbleiben, bis sich der Autopod verbreitert und mit seiner anatomischen Ausbildung begonnen wird[4].

Jeder Finger hat seine eigene Struktur. Positionsbestimmungen und lokale Interaktionen erscheinen daher sogar Finger-spezifisch notwendig. Das erkannte man bei dem Experiment, eine geringe, SHH-getränkte Gewebemasse in das noch nicht abgestorbene weiche Gewebe zwischen dem zweiten und dritten Finger zu transplantieren, bevor diese sich ausbilden. Der an das Transplantat angrenzende zweite Finger entwickelt dann eine Phalanx mehr und ähnelt mehr dem dritten Finger[4]. Die genaue Morphologie der Finger wird demnach durch spezifische Signal-Programme im Knospen-Gewebe zwischen den Fingern geprägt.

Erweitertes French Flag Modell nach Knabe 2008

Ein weiteres Modell ist von Knabe et al. vorgelegt worden[7]. Zum einen ist es ein Beispiel für die Weiterentwicklung des Gedankenguts von Wolpert. Zum anderen setzt es auf Computersimulation auf, den Software-Anwendungen CPM und CompuCell3D. Damit leitet es bereits zu integrierten, systemischen Modellen über. Das Modell beschränkt sich zunächst auf eine zweidimensionale Darstellung, die Ausweitung auf 3D ist vorgesehen. Knabe et al. versuchen, die Zelldifferenzierung entsprechend der drei Stufen blau-weiß-rot in einem abstrahierten evolutionären Prozess modellhaft zu erklären. Dabei stehen Genregulationsmechanismen im Mittelpunkt. Knabe et al. behaupten “Although quite complex models have been realized with CPM, […] the cell level CPM simulation has not been combined with a gene regulation network controlling cell parameters individually, without predefined cell types before”. Es gelingt hier zu zeigen, dass Zelldifferenzierung (blau-weiß-rot) als Ergebnis der Genregulation und Morphogen-Gradientenwirkung zustande kommt. Das Modell ist allerdings sehr abstrahiert und geht nur sehr eingeschränkt von tatsächlichen Morphogenen und Proteinen aus.

Gewebedifferenzierung nach dem Erweiterten French flag model

Selbstregulierendes System interdependenter Zellsignal-Feedback-Loops nach Bénazet, Zeller et al. 2009

(wird nachgetragen)

Epigenetische Modelle

Die evolutionäre Entwicklungsbiologie sieht Musterbildungsprozesse der Extremität nicht primär auf der genetischen bzw. Genexpressionsebene sondern im Zusammenspiel der genetischen mit höheren Organisationseben. Grundlegend für alle im folgenden aufgeführten Modelle ist die Arbeit von Alan Turing (1952)[8]. Turing-Mechanismen, die regelmäßige Muster erzeugen können, sind die epigenetische Mechanik für die morphologische Formfindung der Extremität. Jüngere Modelle gehen dabei nicht mehr von chemischen Diffusionsprozessen aus sondern von Zell-Reaktionen und können auf dieser Basis biologische Aktivator-Inhibitor-Prozesse realistischer abbilden[9].

Integriertes genetisch-epigenetisches Modell von Newman und Müller 2005

Newman und Müller[10] haben den klassischen Modellen eine neue Sichtweise des Entstehens der Hand (Origination und Innovation) gegenübergestellt, die neben den genetischen epigenetische Prozesse sowie die Interaktionen beider ins Blickfeld rückt. Das ist die Perspektive von EvoDevo. Eine Handvoll zellularer und molekularer Kernprozesse des mesenchymen Gewebes bildet die Basis für die Vorgänge. Die Existenz und Übertragung Positionsinformationen in einzelnen Zellen werden nicht benötigt. Damit liefert dieser Denkansatz erstmals eine symstemische Herangehensweise, indem das interdependente Zusammenspiel der Systemkomponenten Gene, Genprodukte, Zellen und Gewebe zugrundegelegt wird. Epigenetische Prozesse sind nach dieser Anschauung nicht nur für die Erklärung des evolutionären Entstehens der Hand (Origination) sondern auch für die Erklärung ihrer Entwicklung bei rezenten Lebewesen grundlegend und unverzichtbar [10].

Epigenetische Formbildung in der Extremität. Links: Hühnchen, rechts 2D-Computersimulation

Drei zentrale Eigenschaften der Epigenese des Systems Entwicklung werden formuliert[11]:

• die Autonomie-Eigenschaften ihrer Komponenten (Zellverhalten, Gewebegeometrie etc.)

• die Fähigkeit des mesenchymen Gewebes bei der Kondensation zu Selbstorganisation und der Ausbildung raum-zeitlicher Muster

• die nicht lineare Reaktionsfähigkeit auf genetische Induktionen bzw. auf Umwelteinflüsse. Das Überschreiten von (Schwellenwerten) kann verantwortlich für diskrete phänotypische Variation oder Innovati-on sein.

Das Modell von Chaturvedi, Hentschel, Alber, Newman 2005

Dieses Modell[12] verwendet Computersimulationen, die die Organogenese der Hand ausgehend von Zell- und Zellkommunikationsprozessen mit Reaktions-Diffusionsgleichungen abbilden können und erstmals auch dreidimensional das potenzielle Entstehen zusätzlicher Finger erfassen. Das Modell basiert auf dem ursprünglichen, jedoch unterschiedlich modifizierten Reaktions-Diffusionsgleichungsansatz von Hentschel et al.[13].

3D-Computersimulation proximo-distaler Musterbildung der Extremität nach Chaturvedi et al. 2005

Folgende Modellgrößen und –methoden werden für die raumzeitlich regulierte Kondensation im Modell von Hentschel et al. verwendet [14]:

1. 3D-Zellenanordnung

2. Cellular Potts Model (CPM), der eigentliche Kern des Modells; ein Simulationsprotokoll, das die raumzeitliche Ordnung beschreibt, in der die Komponenten (Zellen etc.) interagieren bzw. adhäsieren. Das CPM simuliert das kollektive Verhalten von Zellstrukturen. Im Fall hier lässt es Verhaltensweisen von Zellen zu. Das CPM ist ein generalisiertes Ising-Modell. Das Ising-Modell entstammt der theoretischen Physik und erklärt den spontanen Phasenübergang von nichtmagnetischen in magnetischen Zustand von Festkörpern. Es ist in viele andere Wissenschaftsbereiche übernommen worden. Im Fall hier stellt es den physikalischen Formalismus zur Untersuchung der Implikationen dar, dass Zellen je nach Zelltyp untereinander unterschiedlich starke Adhäsion eingehen. Es beschreibt die Modellierung der Zelldynamik unter Berücksichtigung von minimaler, fluktuierender Energiezufuhr. (Das CPM findet hier Anwendung in dem Open Source Computerprogramm CompuCell3D, einem Simulationsprogramm für komplexe biologische Probleme.)

3. Musterinitiierende Turing-Instabilitäten erregbarer Media auf den Ebenen Gewebe, Organe, Organismus.

4. Morphogene Felder als nichtmolekulare Kontinua.

5. Interaktion verschiedener Organisationsebenen (Skalen) durch weitere modulare Standard-Computerprogramme mit definierten Schnittstellen; Informationsfluss von feineren zu gröberen Strukturen bzw. innerhalb jeweils Paaren von Modulen. Die expliziten Ebenen sind:

• Molekularebene (Zellkern),

• Subzellularebene (Mytochondrien),

• Zellebene,

• Zell- und Gewebeebene,

• Gewebeebene,

• Organebene

6. Die entsprechenden mathematisch formulierten Mechanismen, die das Modell auf diesen Ebenen verwendet, sind (beginnend wieder von der molekularen Ebene):

• Produktion von Morphogenen TGF-ß, FGF-2 und FGF-8; TGF-ß erzeugt Schwellenwerteffekte;

• Erzeugung eines Fibronektinfelds,

• Diffusion extra- und intrazellularer chemischer Stoffe durch Reaktions-Diffusions-gleichungen,

• Genregulation,

• Regulation der Zelladhäsion,

• Zelldynamik und Antwort auf morphogene Felder,

• Zellmembranfluktuation,

• Zellwachstum

• Mitose (Zellkernteilung),

• Apoptose (programmierter Zelltod),

• Zelldifferenzierung,

• zellspezifische Beweglichkeit zwischen Zellen sowie zwischen Zellen und der extrazellularen Matrix,

• Haptotaxis (keine Chemotaxis),

• extrazellulare Matrix, durch die die Morphogene diffundieren (Zellflüssigkeit),

• sowie auf der obersten Ebene,

• Thermodynamik und Mechanik von kondensiertem Gewebe.

Das Chaturvedi-Modell beruht auf relativ wenigen molekularen Prozessen, verwendet aber ein Vielzahl zellularer und supra-zellularer Mechanismen. Es kann mit diesem Vorgehen grobe skelettäre, räumliche Strukturen darstellen. An der Einbindung der Wirkungsweise von Gli3, Wnt-7 und Shh, die die Extremitätengeometrie und Zonen kontrollieren, wird gearbeitet[15], was schrittweise zu noch größerer Realitätsnähe der Modelle führen wird. Organisatorregionen in der Knospe, wie AER und ZPA, aber auch die Wachstumszone sind apriorisch unterlegt. Ihr Entstehen wird also nicht wiedergegeben. Ihre spezifische Lokation in der Knospe spielt keine Rolle im Modell. Dieses Modell setzt aus Rechenkapazitätsgründen nicht primär auf molekularen Prozessen auf[15]. Sein innerer Kern ist mit der CPM-Software-Anwendung die Zelle.

Das Modell von Zhu, Zang, Alber Newman 2010

2010 wurde ein Simulationsmodell publiziert, das erweiterte Erkenntnisse zur Extremitätenentwicklung liefert und auch evolutionäre Unterschiede aufzeigen kann [16].

Das Modell setzt wie das vorige auf dem Modell von Hentschel et al. (2004)[13] auf, basiert damit ebenfalls auf Aktivator-Inhibitorgleichungen und somit auf Selbstorganisationsfähigkeit, die sich außerhalb genetischer Informationen im Mesenchym einstellt. Es erfordert keine apriori Positionsinformationen. Aktivatoren und Inhibitoren sind vergleichbar zu dem Modell von Newman und Müller(2005)[14]. Auf die Problematik, dass bis heute kein einzelnes Morphogen empirisch als Inhibitor ausgemacht werden kann und dass noch wenig zuvor die molekulare Identität des Inhibitors als schwer fassbar bezeichnet wird, gehen Zhu et al. nicht näher ein. Ein Inhibitor muss vorausgesetzt werden, anders ist das Modell nicht darstellbar. Dabei steht BMP im Mittelpunkt der Betrachtung. BMP-Aktivität wird von unterliegenden molekularen „Prepattern“ diktiert, durch die erst das zellulare Pattern konfiguriert wird. Erst durch einen solchen mehrstufigen, auf der molekularen Ebene heute noch nicht transparenten Prozess wird der Diffussionsverlauf bestimmt.

Im Simulationsmodell (Video unten) folgen Wachstum und Kondensation dem Progressionzonenmodell. Deutlich sind die AER (rechts außen), eine schmale Progrssionszone (Mitte) und die Wachstumszone auszumachen.

Das Modell erzeugt zweidimensionale Muster und ist im Vergleich zu den Modellen von Hentschel, Newman-Müller und Chaturvedi von der Zahl der Gleichungen weiter vereinfacht und auf zwei Reaktions-Diffusionsgleichungen rg der Knochen (s. Abb.) wurde mittels Änderungen so genannter kinetischer Reaktionsparameter erzielt, die die Produktionsraten des Aktivaeduziert. Fortschritte werden in der Hinsicht erreicht, dass nunmehr die unterschiedlichen Zonen der Knospe wie AER, Frozen Zone, Wachstumszone unterschieden werden. Unterschiedliche Zellprozesse, die empirisch ablaufen, sind eingearbeitet, bzw. werden im Modell konstant gehalten. Sogar eine Ausweitung der AER im Verlauf des Wachstums der Knospe ist enthalten. Man geht von einer gekrümmten apikalen Kontur aus. Allgemein ausgedrückt berücksichtigt das Modell die Formveränderung (reshaping) des Knospengewebes.

Im Vergleich zu den Vorgängermodellen können Asymmetrien im Autopod dargestellt werden, d.h. Unterschiede in den skelletären Elementen hinsichtlich der Anzahl Zehen oder deren Länge, wie sie empirisch bei unterschiedlichen Spezies tatsächlich vorkommen. Shh und Hoxaktivitäten sind berücksichtigt. Evolutionäre Übergänge können erzeugt werden. Die Musterergebnisse dieses Modells entstehen nicht auf der unteren, genetischen Organisationsebene. Vielmehr spiegeln die Turinggleichungen die Selbstorganisation des Zellgewebes der Knospe wieder, also autonome Eigenschaften, die erst auf dieser Ebene zustande kommen. Hoxgene, Genregulierungen, vor allem Transkriptionsfaktoren, sind mitbestimmend für die Parameter der Gleichungen. Sie lenken und verfeinern so die räumliche Ausrichtung der Knochen, sind aber nicht die eigentlich formgebenden Faktoren. Diese sind epigenetisch. Die evolutionär oder artenspezifisch unterschiedliche Länge, Dicke und Ausrichtung der Knochen wurde mittels Änderungen so genannter kinetischer Reaktionsparameter erzielt, die die Produktionsraten des Aktivator-Morphogens darstellen bzw. die für die Assoziationsgeschwindigkeits-Konstante von Aktivator und Inhibitor stehen.

Zhu et al. simulieren sowohl den proximo-distalen Auswuchs der Knospe als auch die antero-posteriore Musterbildung des Autopods, d.h. die Anzahl der Zehen. Diese korrelieren positiv mit zunehmender Breite des Autopods. Für die Verbreiterung des Autopods wird ein Parameter verwendet, der als Simulation der Shh-Expression der ZPA verstanden werden kann. Die Simulation, basierend auf kontinuierlichen Änderungen auf der Gen- und Zellebene, bildet also diskrete Elemente aus. Das ist chakateristisch für epigenetische, Turing-basierte Modelle.

Kritische Würdigung der Modelle aus Gegenwartssicht und zukünftige Forschungsschwerpunkte

Lange Zeit haben mit den beiden klassischen Modellen, dem Morphogen-Gradienten-Modell und dem Progressionszonen-Modell, getrennte Betrachtungen zur Strukturbildung der Hand existiert, einmal die Erklärung durch die Prozesse entlang der proximo-distalen Achse, zum anderen durch die davon zuerst unabhängige Erklärung der ZPA-Prozesse entlang der antero-posterioren Achse. Keines der Modelle kann jedoch für sich allein die räumliche Ausbildung der Identitäten in der Knospe, und vor allem des Autopods, hinreichend erklären. Jedes der Modelle wird zwar durch die erläuterten empirischen cut-and-pace-Versuche bestätigt. Letztlich werden aber – folgt man der Logik der genannten Modelle - die Koordinaten erst dann exakt bestimmbar, wenn den betreffenden Zellen sowohl ihr Ort auf der proximo-distalen Achse, als auch der auf der antero-posterioren Achse und genau genommen auch der auf der dorso-ventralen Achse mitgeteilt werden kann. Es muss demnach aus dieser Sicht in der Embryogenese der Hand Prozesse geben, die es möglich machen, dass Zellen Positionspunkte auf allen drei Achsen interpretieren können.

Die anhaltenden Schwierigkeiten, Positionssignale empirisch aufzudecken, führte andere Wissenschaftler zu der mehr holistischen, systemischen Erklärung der Strukturbildung, zumindest in Richtung der beiden Hauptachsen. Die Weiterentwicklungen auf diesem Gebiet sind im Fokus aufwändiger, disziplinübergreifender, computergestützter Forschungsarbeiten. Die Herausforderungen liegen dabei (a) in der empirischen Bestimmung eines weitreichenden Inhibitors, (b) der Integration der dorso-ventralen Achse, was die Modell dreidimensional werden lässt, (c) im Übergang zu eher stochastischen im Vergleich zu den bisher deterministischen Modellen bezüglich Genexpression, Zellprozessen ect. und damit (d) im Nachweis der Robustheit der verwendeten Zellprozesse, also ihrer Störunanfälligkeit gegenüber stochastischem Rauschen[17] sowie (e) in der Entwicklung geeigneter Methoden, um die Distribution von SHH und anderer Morphogene in der sich entwicklenden Knospe realtime sichtbar zu mache<nref name="Tickle-Barker-2012">Tickle, C. and Barker, H. 2012: a.a.O.</ref>.

Methoden der empirischen Forschung

Die ersten Jahrzehnte standen vorrangig in experimentellen Transplantationsversuchen. Zunächst wurden Grafts aus der entstehnden Knospe entfernt und an anderen Stellen wieder eingepflanzt. Als die ZPA und AER und ihre Positionen bekannt waren, hat man diese Organisatorregionen von anderen Tieren entnommen und am Untersuchungsobjekt neu eingefügt, z.B. die ZPA anterior zusätzlich zu der posterioren. Ferner wurden diese Komponenten zu früheren oder späteren Zeitpunkten oder in kleineren Dosen eingepflanzt. Dadurch erhoffte man sich Erkenntnisse über Veränderungen der Skelettbildung. In jüngerer Zeit wird molekularbiologisch vor allem mit Knock-Out-Genen operiert. Durch das Abschalten von Genen kann man auf deren Funktion bei der Entwicklung der Extremität schließen. So hat das Experiment von Litingtung 2002[18] zu der überraschenden Erkenntnis geführt, dass ein Doppel-Knock-Out von Sonic Hedgehog und Gli3 (Shh-/-, Gli3-/-) eine polydaktyle Hand erzeugt, womit man nicht gerechnet hat. Beide Gene sind demnach für die Fingerbildung entbehrlich, wenn sie gemeinsam ausgeschaltet werden.

Robustheit versus Plastizität der Zehenzahl

Extremität früherer Landwirbeltiere, hier Acanthostega mit 8 Zehen

Die Wirbeltierextremität ist eine sehr robuste anatomische Form. Gleichzeitig zeichnet sie sich evolutionär durch eine extreme Anpassungsfähigkeit aus, wie man an ihren unterschiedlichen Formen von Wirbeltierarten erkennt, z. B. Maus, Vogel, Fledermaus, Pferd, Mensch etc. Beide Eigenschaften erscheinen intuitiv als Widerspruch. Andreas Wagner konnte zeigen, dass robuste Formen mit ausgeprägten Gennetzwerken bessere Voraussetzungen für Variation und Innovation besizuen als weniger robuste Formen [19].

Die pentataktyle Obergrenze der Hand (fünf Finger) ist aber nicht abschließend geklärt. Frühe Saurierarten (Acanthostega) werden heute wegen der Ähnlichkeit der Zehen eher als polydaktyl, denn als achtzehig interpretiert. Es gibt keine Wirbeltierart, die im Standard mehr als fünf Finger oder Zehen an einer Extremität hat. Ausnahmen mit selektiver Einflussnahme des Menschen sind bestimmte Populationen der Katze (Maine-Coon-Katze) und der Norwegische Lundehund. Galis führt Entwicklungsconstraints als Grunf dafür an, dass eine größere Fingerzahl verhindert wird [20]

Sonic Hedgehog - ein Schlüsselgen für die Extremitätenentwicklung

Über kein anderes Gen bzw. Protein sind mehr wissenschaftliche Arbeiten zur Entwicklung der Wirbeltierextremität verfasst worden als über Sonic Hedhog. Zahllose Experimente wurden mit der ZPA unternommen, um deren Wirkungsweise zu bestimmen, bevor bekannt war, welches das Morphogen in der ZPA ist. Als Tabin 1993 entdeckte, dass Sonic Hedgehog das Morphogen darstellt, dass in den Zellen der ZPA exprimiert wird und in den extrazellularen Raum des Autopod von posterior nach anterior diffundiert, wurde die Konzentration auf die Erforschung der Wirkungsweise von Sonic Hedgehog noch höher. Die Proliferation von Zellen im Zuge der Shh-Expression und damit das anterio-posteriore Wachstum der Knospe als KOnsequenz der ZPA wurde deutlich. NAch Tickle ist SHH heute als wichtiges Morphogen für die Patternbildung im Autopod bestätigt. Seine weitreichende Wirkung ist sowohl abhängig von der Dosis als auch von der Dauer der Diffusion. Die ZPA kontrolliert sowohl die Anzahl als auch Identität der Finger [21]. Die meisten daumenseitigen Felhbildungen der Hand (präaxiale Polydaktylie) hängen mit Expressionsänderungen von Shh zusammen.

Sonic Hedgehog Expression in der ZPA mit Zellproliferation

Heute geht man nicht mehr davon aus, dass die diffundierende Wirkungsweise von SHH ausreichend exakt sein kann, um die Positionbestimmung der Zellen (Knorpelbildung und angrenzendes Gewebe bzw. exakte Skelettform) alleinig verantworten zu können [22]. Es ist aber nicht auszuschließen, dass SHH selbst nicht in abgestufter Wirkung wirkt, sondern dass von ihm die Produktion eines anderen Stoffes induziert wird, der die entstprechende Gradientenwirkung aufweist und weitergibt. Hierzu wird intensiv geforscht[23].

Sonic Hedgehog war auch eines der ersten Gene, für das ein ein bei Säugern und Fischen gleichermaßen hoch konserviertes, nicht codierendes cis-Regulatorelement (ZRS) gefunden wurde, das die Shh-Expression im Detail steuert. Mutationen in ZRS führen zu präaxialer Polydaktylie (Lettice et al. 2008).

Neben seiner Wirkung im Autopod interagiert Shh über die ZPA mit der AER und hält deren Funktion während des Wachstums der Knospe dauerhaft aufrecht. Umgekehrt wird Shh nicht mehr exprimiert, wenn die AER beseitigt wird.FGF4 agiert zur Aufrechterhaltung von Shh und Shh zur Aufrechterhaltung von FGF4. Ohne diese Interaktion werden Finger entweder sinifikant reduziert oder fehlen vollständig..

Wichtige Proteine mit Transkriptionsfaktoren, cis-Elemente und ihre Funktion in der Extremitätenentwicklung

Protein Funktion
BMP Familie der Bone Morphogenetic Proteine, gehören zum TGF-ß Signalweg. BMP-Signal-Transduktionsweg ist beteiligt an Entwicklung von Fingern und Hand bzw. zahlreichen Fehlbildungen[24],[25]. Bei Zhu et al. (2010)[26] bestimmt BMP-Umgebung den lateralen Inhibitor.
cis-Regulatormodul nicht kodierender Abschnitt auf der DNA, an den eine Reihe von Transkriptionsfaktoren binden kann, die die Expression eines oder mehrerer umliegender Gene regulieren
CNE highly conserved non coding element auf der DNA; CNEs werden in Zusammenhang gebracht mit dort anbindenden Transkriptionsfaktoren, die die Regulation umliegender Gene steuern[27].
dHAND (auch Hand2) Transkriptionsfaktor, aktiviert Shh
FGF Familie der Fibroblast Growth Factor Protein. FGF´s induzieren AER. Wichtige Wachstumsfaktoren zur Bildung der der AER proximal anschließenden Progressionszone, d.h. für die dortige Zellproliferation und -differenzierung. FGF8 in der AER; kontrolliert die Shh-Expression und umgekehrt[28]. FGF4 ist ein wichtiger Shh-Inducer[29] .
GLI3 Mitglied der GLI-Proteinfamilie. Komponente des Shh-Signalwegs. Gli3 wird bei der Maus mit Fingerspezifikation und Polydaktylie assoziiert[18]. Polydaktylien durch assoziierte Gli3-Punktmutatione<nref name="Driess-2005">Driess, S.J. 2005: Punktmutationsanalysen bei GLI3-assoziierten Krankheitsbildern: Greig Cephalopolysyndaktylie-Syndrom, Pallister-Hall-Syndrom und isolierte Polydaktylien. Dissertation</ref>. Gli3 wirkt repressiv auf Shh; kombiniertes Aussetzen von Gli3 und Shh bei der Maus wird mit Polydaktylie verbunden[18]. Maßgeblich verantwortlich für die antero-posteriore-Limb-Asymmetrie wegen der posterioren Shh-Downregulierung.
HOX Familie der Hox-Moleküle; viele davon beteiligt an fundamentaler Struktur- u. Symmetrie-Entwicklung des Embryos, unter anderem auch der Hand. Die Hoxgene sind angeordnet in 4 Clustern (A-D) mit je bis zu 13 Hoxgenen; u.a. sind Hoxd11 und Hoxd13 an Fingerbildung beteiligt; ferner Hoxa13[30],[31]. Tabin bespricht die strenge Abfolge von Hoxd8 bis Hoxd4 Expression sowie Hoxa10 bis Hoxa7-Expression als entscheidend für die Fingerzahl[32].
RA Retinoid Acid (Retinsäure), Vitamin A, Morphogen, ähnlich SHH, aber nicht allein ausreichend für Fingerbildung bzw. –identität wie ursprünglich angenommen[33]. Kann aber Fingerduplizierung ektopisch bewirken und eine ektopische ZPA imitieren[34]. RA reguliert SHH positiv.
SHH Morphogen. Eines von 3 Proteinen im Hedgehog-Signal-Transduktionsweg, beteiligt u.a. an Identifikation und Anzahl der Finger sowie ursächlich bei präaxialer Polydaktylie[35],[36]. Shh-Interaktion mit Gli3 ist grundlegend für Fingerinitiation und –identifikation (Wagner & Larsson in Hall 2007, 55). SHH kontrolliert außerdem die Produktion von FGFs[37]. FGF´s, TBX2, HAND2 und andere Proteine steuern die Expression von Shh[38].
TBX Proteinfamilie von Transkiptionsfaktoren. Zugehörige Gene enthalten die T-Box, eine gemeinsame DNA-bindende Domäne. TBX3 ist u.a. beteiligt an anterior-posterior-Axenbildung; TBX5 ist u.a. beteiligt an Spezifizierung von Fingeridentitäten. TBX2 reguliert Shh[39].
TGF-ß Transforming Growth Factor, Wachstumsfaktor (Protein); kontrolliert Zellproliferation und –differenzierung. In den Modellen Newman & Müller (2005)[10], Newman & Bhat (2007)[40], Zhu et al. (2010)[16] ist TGF-ß die Aktivatorumgebung.
WNT Morphogenfamilie, wichtiger Signalweg. WNT5 wird durch FGFs angeregt für gerichtetes Wachstum der proximal-distalen Achse in distaler Richtung[41].
ZRS (auch MFCS1) ZPA regulator sequence; long range, nicht kodierende, hoch-konservierte cis-Regulator-Region im Intron 5 des LMBR1-Gens, verantwortlich für die Regulation der Shh-Expression[35],[36]. Shh ist das Zielgen (Promoter) für die von der ZRS ausgehenden komplexen Regulierungen.

Meilensteine in der Erforschung der Extremitätenentwicklung

Jahr Forscher Entdeckung
1948 John W. Saunders and Marry T. Gassseling[42] Identifikation der AER im Hühnchen-Flügel
1952 Alan Turing[43] Oszillierende chemische Reaktionen als Entwicklungsmechanismen, beschrieben in partiellen Differenzialgleichungen (Turing-Mechanismus).
1968 John W. Saunders and Marry T. Gasseling[44] Identifikation der ZPA; Anteriore Transplantation der ZPA; Verdoppelung von Fingern beim Hühnchen.
Zehenverdoppelung im Hühnchenflügel nach posteriorer Transplantation der ZPA
1969 Lewis Wolpert[45] Morphogen-Gradienten-Modell
1976 Dennis Summerbell[46] Progressionszonen-Modell
1975/1981 Cheryll Tickle[47] ZPA-Transplantationen an unterschiedliche unterschiedliche anteriore Positionen; Experimente zur Unterstützung des Morphogen-Gradienten-Modell; Polarisierende Signale sind Dosis-abhängig
1982 C. Tickle, B. Alberts, L. Wolpert, J. Lee[48]; parallel auch D. Summerbell[49] Retinsäure als erstes Morphogen identifiziert, das eine neue polarisierende Region induzieren kann.
1983 Hans Meinhardt[50] Mathematische Modelle biologischer Patternformation
1993 R. D: Riddle, R. L. Johnson, E. Laufer, Clifford J. Tabin[51] Sonic Hedgehog wird als das Morphogen der ZPA identifiziert
1993 L. Niswander, C. Tickle, A. Vogel, I. Booth, G. R. Martin[52] Die AER ist die kritische Signalquelle, die das proximo-distale Wachstum über die Produktion von Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGFs) kontrolliert
1997 J. Yang et al.[53] Untersuchungen zu Shh in Dosis-, Zeit- und Distanz-Wirkung
2001 Zeng et al. [54] Direkter Nachweis, dass Shh langreichend durch die anterior-posteriore Knospe diffundieren kann
2001 Gritli-Linde et al. [55] Direkter Nachweis, dass Shh kurzreichend und graduell weitreichend wirken kann
2002 Ying Litingtung et al.[56] Shh und Gli3 sind entbehrlich, aber regulieren Zehenzahl und –identität; Autopod ohne Shh- und Gli3-Expression ist polydaktyl ohne Identitäten der Zehen.
Knock-Out von Shh und Gli3 führt zu polydaktylem Autopod ohne Identitäten
2002 A. T. Dudley, M. A. Ros, C.J. Tabin[57] Early specification model als Gegenmodell zum Progresszonen-Modell
2003/2008 Laura A. Lettice, Robert Hill et al.[58],[59] ZRS als cis-Regulatorelement für Shh; Entdeckung mehrerer Punktmutationen in der ZRS, die präaxiale Polydaktylie bei Mensch, Maus und Katze induzieren.
2004 B. D. Harfe, P. J. Scherz, S. Nissim, A. P. McMahon, C. J. Tabin[60] Temporale Wirkung von Shh in Ergänzung zur bisherigen Dosis-Abhängigkeit
2005 Stuart A. Newmann and Gerd B. Müller[61] Ein Kernsatz zellularer und molekularer Prozesse ist verantwortlich für Selbstorganisation beim Limb Patterning.
2006 S. Nissim, P. Allard, B. D. Harfe, C. J. Tabin[62] Bestimmung einer neuen Tbx-Organisatorregion in der Knospe; sie unterdrückt die anteriore Shh-Expression
2006 Takashi Miura et al.[63] Mixed-Mode-Pattern im Double-foot Mutant; Turing Simulation einer wachsenden Knospe zeigt unterschiedlichen Bifurkationspunkte und Fingerbreite.
2006 C. Tickle [64] Zell-Zell-Signale in mesenchymen Zehen-Zwischenräumen sind verantwortlich für die Identität der Zehen vor Eintreten der Apoptose
2007 C. J. Tabin, L. Wolpert[65] Revision des French Flag Modells; Kritik am Progressionszonen-Modell
2008 J. F. Knabe et al.[7] Erweitertes French Flag Modell: Computer basiertes Genregulationsmodell; individuelle parametrisierte Zell-Differnezierung; Zell-Zell-Kommunikation
2009 M. Towers, C. Tickle[66] Integration von Wachstum und Digit-Spezifikation beim Patterning des Hühnchen Flügels
2009 J. D. Bénazet, Rolf Zeller et al. [67] Selbstregulierendes System interagierender Feedback-Loops kontrolliert die Musterbildung der Maus-Extremität
2010 J. Zhu, Y. T. Zhang, M. S. Alber, S. A. Newman[68] Turing basiertes, Computer-Regulationsnetzwerk reproduziert wichtige Eigenschaften der Wirbeltier-Extremitätenentwicklung und -evolution.
2011 K. L. Cooper, M. A. Ros, C. J. Tabin[5] Proximo-distales Patterning: Zellen können nicht Zeit interpretieren. Stattdessen existiert eine dynamische Balance zwischen der proximalen Retinsäure und den distalen FGFs, wodurch die proximo-distalen Segmente beim Hühnchen gesteuert werden. Gegenthese zum Progressionszonen-Modell.
2011 A. Roselló-Diez, M. A. Ros, M. Torres[6] Diffundierende Signale, nicht autonome Mechanismen bestimmen die Hauptunterteilung der proximo-distalen Achse. (Ähnlich zu Cooper et al. 2011)

Weiterführende Literatur und Internetartikel

Einzelnachweise

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  6. ↑ a b Roselló-Díez, A.; Ros, M. A.; Torres, M. (2011): Diffusible Signals, Not Auto-nomous Mechanisms, Determine the Main Proximo-distal Limb Subdivision. Science 27 May 2011: Vol. 332 no. 6033 1086-1088 Referenzfehler: Ungültiges <ref>-Tag. Der Name „“Roselló-Diez-2011““ wurde mehrere Male mit einem unterschiedlichen Inhalt definiert.
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  61. ↑ Newman, S. A. und Müller, G. B. 2005: Origination and Innovation in the Vertebrate Limb Sekeleton: An Epigenetic Perspective. JOURNAL OF EXPERIMENTAL ZOOLOGY (MOL DEV EVOL). 2005, S. 593–609
  62. ↑ Nissim, S., Allard, P. Bandyopadhyay, A., Harfe, B.D., Tabin, C. J. 2006: Characterization of a novel ectodermal signaling center regulating Tbx2 and Shh in the vertebrate limb. Developmental Biology 203,pp. 9-21
  63. ↑ Miura, T.; Shiota, K.; Morris-Kay, G.; Maini, P. K.;. 2006: Mixed-mode pattern in Double-foot mutant mouse limb - Turing reaction diffusion model on a growing domain during limb development. Journal of Theoretical Biology. 2006 Jun 21; 240(4):562-73. Epub 2005 Dec 2006
  64. ↑ Referenzfehler: Ungültiges <ref>-Tag; kein Text angegeben für Einzelnachweis mit dem Namen Tickle-2006.
  65. ↑ Wolpert, L. and Tabin, C. J. 2007: Rethinking the proximo-distal axis of the vertebrate limb in the molecular era. Genes & Dev. 2007. 21: 1433-1442
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  68. ↑ Jianfeng Zhu, Yong-Tao Zhang, Mark S. Alber, Stuart A. Newman (2010): Bare Bones Pattern Formation: A Core Regulatory Network in Varying Geometries Reproduces Major Features of Vertebrate Limb Development and Evolution. http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0010892.
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