Die Feldflussfraktionierung (englisch Field-Flow Fractionation[1]; abgekürzt: FFF) ist eine Technik der analytischen Chemie. Es handelt sich um eine Art der Flüssigchromatographie ähnlich der Gel-Permeations-Chromatographie. Die Trennung findet hier jedoch nicht in Säulen, sondern in Flusskanälen statt. Typische Anwendungen sind die Analyse von Nanopartikeln, Makromolekülen wie synthetischen Polymeren, Biopolymeren (z. B. Polysaccharide) und Proteine. Vorteile aller FFF-Systeme ist das über die Software frei einstellbare Trennfeld. Somit können verschiedene Proben hintereinander ohne Säulenwechsel vermessen werden. In den FFF-Systemen treten kaum Wechselwirkungen oder Scherkräfte auf und somit sind die Systeme für schwierigste Proben geeignet. Eine der neusten Entwicklungen ist ein Hochtemperatur-FFF-System zur Analyse von Polyethylen.
Historie und Erfindung
Die Technik wurde im Jahr 1966[2] von Calvin Giddings (* 1930, † 1996) an der University Utah in Salt Lake City, USA erfunden und patentiert.
Giddings war eine bekannter amerikanischer Wissenschaftler, der auch im Bereich der Chromatographie forschte. Bekannt wurde er jedoch für seine Arbeiten auf dem Gebiet der Field-Flow Fractionation. Er war Gründer des „Field-Flow Fractionation Research Center“ (FFFresearch Center) an University of Utah. Dort entwickelte und beschrieb er zusammen mit seine Mitarbeitern und Kollegen in vielfältigen Publikationen die „Theory der Field-Flow Fractionation“ und auch die meisten der bislang bekannten Varianten der Field-Flow Fractionation. Prof. Giddings und sein Team entwickelten dort zunächst die Thermal Field-Flow Fractionation (Thermische Feldflussfraktionierung)[3] in 1969, gefolgt von der Sedimentation Field-Flow Fractionation (Sedimentations Feldflussfraktionierung)[4] in 1974, der Flow Field-Flow Fractionation (Fluss Feldflussfraktionierung)[5] in 1976 and schließlich der Split Flow Thin Cell Fractionation (SPLITT) in 1985[6].
Funktionsprinzip
Die Field-Flow Fractionation ist eine Trennmethode bestehend aus unterschiedlichen Subvarianten. Diese FFF-Varianten verwenden alle das gleiche generelle Trennprinzip, jedoch unter Anwendung unterschiedlicher Trennfelder bzw. -kräfte. Je nach eingesetztem Trennfeld, spricht man daher von Flow Field-Flow Fractionation, Sedimentation Field-Flow Fractionation, Thermal Field-Flow Fractionation oder Gravimetric Field-Flow Fractionation. Es gibt auch eine präparative Variante, welche Split Flow Thin Cell Fractionation (SPLITT Field-Flow Fractionation) genannt wird. Ingesammt bietet die FFF-Methode eine schnelle, sehr schonende und hochauflösende Trennung von partikulären Substanzen in flüssigen Medien im Größenbereich von 1 nm bis 100 µm und 1 kDa bis in den Megadalton-Bereich. Dabei läuft die Trennung ohne Säule in einem offenen, flachen und laminar durchströmten Trennkanal ab, der keinerlei stationäre Phase mehr enthält. Aufgrund des parabolischen Strömungsgeschwindigkeitsprofils innerhalb des Kanals, nimmt die absolute Fließgeschwindigkeit von der Kanalober bzw. -unterseite her zum Kanalmittelpunkt hin zu, wobei im Zentrum des Kanals die höchste Strömungsgeschwingkeit herrscht.
Je nach eingesetzter Variante der Field-Flow Fractionation werden unterschiedliche Trennfelder eingesetzt, wie z. B. ein zweiter Flüssigkeitsstrom (Flow FFF), Zentrifugalkräfte (Sedimentation FFF), Temperaturgradienten (Thermal FFF) oder auch nur die Erdgravitation (Gravitational FFF). Diese Trennfelder werden dabei üblicherweise im rechten Winkel zur laminaren Kanalströmung angelegt. Unter dem Einfluss dieser Trennfelder und der entgegengerichteten Eigendiffusion der zu trennenden Teilchen stellt sich eine dynamischen Kräftegleichgewicht ein. Für kleinere Teilchen mit stärkerer Eigendiffusion liegt diese Gleichgewichtslage räumlich höher im Strömungskanal als für größere Teilchen mit geringerer Diffusionskraft. Aufgrund der im Kanal vorherrschenden laminaren Strömung befinden sich die kleineren Teilchen im zeitlichen Mittel in schnelleren Strömunsglinien und werden zeitlich vor den größeren Teilchen aus dem Kanal eluiert. Koppelt man die FFF-Trennung mit Chromatographie-Detektoren, wie z. B. Massenspektrometern, Lichtstreuphotometern, Absorptionsphotometern, Brechungsindexmessung oder Fluoreszenzspektroskopie, werden sogenannte Fraktogramme erhalten, welche ähnlich einem Chromatogramm zu bewerten sind. Die Besonderheit bei einem Fraktogramm ist jedoch, dass die Peaks mit zunehmender Retentionszeit eine zunehmende Partikelgröße bzw. ein zunehmendes Molekulargewicht repräsentieren, da die Trennung in der Field-Flow Fractionation größenbasiert abläuft und nicht auf der Wechselwirkung zwischen einer mobilen und einer stationären Phase beruht, wie es bei der Chromatographie der Fall ist.
Aufbau eines FFF-Systems
Die wesentlichen Bestandteile eines FFF-Systems sind ein bis vier Pumpen, Injektionssystem, Trennkanal und verschiedene Detektoren. Die Pumpe saugt das Laufmittel an und erzeugt einen konstanten Fluss durch den Trennkanal, während ein Trennfeld herrscht. Häufig wird das Laufmittel durch einen sogenannten Inline-Degasser gesaugt, der gelöste Gase entfernt. Nach der Pumpe steht das Injektionssystem, entweder manuell oder ein Autosampler. Hier findet die Probe ihren Weg in das System. Im darauf folgenden Trennkanal wird die Probe je nach Trennfeld gemäß ihren Eigenschaften (hydrodynamischer Radius, Molmasse) aufgetrennt. Die verschiedenen Detektoren liefern dann je nach Art bestimmte Aussagen. Letztendlich landet der gesamte Fluss (inklusive Probe) in einem Abfallgefäß. Der Fluss kann aber auch in einzelnen Gefäßen aufgefangen werden.
Trennsysteme
Grundsätzlich wird zwischen vier Systemen unterschieden.
- Symmetrische Feldflussfraktionierung (SF4)
- Asymmetrische Feldflussfraktionierung (AF4)
- Sedimentations-Feldflussfraktionierung (SF3)
- Thermische Feldflussfraktionierung (TF3)
Detektoren
Als Detektoren finden Brechzahldetektoren (auch RI-Detektor von engl. refractive index), UV-Detektoren, Infrarot-Detektoren (IR), Viskosimeter und Lichtstreudetektoren Einsatz. Generell unterscheidet man bei den Detektoren die so genannten Konzentrationsdetektoren, deren Signal proportional zur Konzentration ist (RI, UV und IR) von den molekülmassensensitiven Detektoren (Viskosität, Lichtstreuung).
Kalibrierung
Konventionelle Kalibrierung unter Verwendung eines Konzentrationsdetektors: Zur Kalibrierung werden Polymerstandards mit niedrigen Polydispersitäten eingesetzt. Als Ergebnis erhält man relative molare Massen.
Bei Verwendung eines Konzentrationsdetektors in Verbindung mit einem Viskositätsdetekor: Zur Kalibrierung werden Polymerstandards mit niedrigen Polydispersitäten eingesetzt und eine Kalibrationskurve Log (molare Masse × intrinsische Viskosität) aufgestellt. Da das Produkt von (molarer Masse × intrinsische Viskosität) proportional zum hydrodynamischen Radius ist, lassen sich so die relativen bzw. absoluten molaren Massen berechnen.
Lichtstreudetektion
Durch Einsatz eines Lichtstreudetektors entfällt das Aufstellen einer Kalibrationskurve. Der Lichtstreudetektor misst direkt die absoluten molaren Massen. Zur Auswertung ist zusätzlich ein Konzentrationsdetektor notwendig. Die Rayleigh-Gleichung ist die zentrale Gleichung die den Zusammenhang zwischen der gestreuten Lichtintensität, die durch das so genannte Rayleigh-Verhältnis R(θ) ausgedrückt wird, der Polymerkonzentration c und der gewichtsgemittelten Molekülmasse Mw herstellt. Dabei ist K eine optische Konstante und A2 der zweite Virialkoeffizient.
Einzelnachweise
- ↑ General Introduction into Field-Flow Fractionation. (englisch)
- ↑ J. C. Giddings: New separation concept based on a coupling of concentration and flow non-uniformities. In: Separation Sci. 1, 1966, S. 123–125.
- ↑ G. H. Thompson, M. N. Myers, J. C. Giddings: Thermal field-flow fractionation of polystyrene samples. In: Analytical Chemistry. Band 41, Nr. 10, 1969, S. 1219–1222, doi:10.1021/ac60279a001.
- ↑ J. C. Giddings, F. J. F. Yang, M. N. Myers,: Sedimentation Field-Flow Fractionation. In: Anal. Chem. 46, 1974, S. 1917–1924.
- ↑ J. C. Giddings, F. J. Yang, M. N. Myers: Flow Field-Flow Fractionation: A Versatile New Separation Method. In. Science. 193, 1976, S. 1244-2145.
- ↑ J. C. Giddings: A System Based on Split-Flow Lateral-Transport Thin (SPLITT) Separation Cells for Rapid and Continuous Particle Fractionation. In: Sep. Sci. Technol. 20, 1985, S. 749–768 (doi:10.1080/01496398508060702.