Ein Western Blot (syn: Immunoblot) ist eine Methode der Biochemie, um in einer Probe bestimmte Proteine mit spezifischen Antikörpern nachzuweisen, sie gibt auch Informationen über die Molekülgröße. Der Western Blot beruht auf der Southern-Hybridisierung. Sie wurde 1975 von Edwin Southern für die Analyse von DNA-Fragmenten entwickelt. Die Bezeichnung des Verfahren kommt vom Englischen to blot und bedeutet mit Löschpapier aufsaugen, was eine Grundlage des Verfahrens wiedergibt.
Mit Hilfe eines Western Blot lassen sich Proteine mit einer bestimmten Aminosäure-Sequenz aufspüren. Die Technik funktioniert ähnlich wie bei anderen Blot-Methoden, wie dem Southern-Blot für das Aufspüren von DNA und dem Northern-Blot für das Auffinden von RNA.
Methode
Das Grundprinzip des Blottings liegt in der Elektrophorese. Hierbei diffundiert das zu untersuchende Protein innerhalb eines sich auf einer Glasplatte befindenden halbfesten Trägermaterials (in der Regel Agarosegel oder Polyacrylamid) entlang einer angelegten Gleichspannung. Da sich die Molekülgröße innerhalb des Untersuchungsmaterials unterscheidet, geschieht diese Diffusion mit unterschiedlicher Geschwindigkeit, so daß sich die Probe nach ihrer Beschaffenheit auftrennt.
Nach Abschluß der Elektrophorese muß das Ergebnis sichtbar gemacht werden. Hierfür legt man auf das Gel einen Nitrozellulose-Filter auf und überträgt die aufgetrennten Proteine mittels einer Pufferlösung auf den Filter. In der sich anschließenden Hybridisierung werden die Moleküle mittels einer radioaktiven Substanz markiert. Die durch die Zerfallsprozesse des Markers verursachte Strahlung belichtet schließlich einen Röntgenfilm und macht das ursprüngliche Diffusionsergebnis sichtbar.
Anlehnend an den Namen Southern wurden weitere Varianten entwickelt: So wird die entsprechende Übertragung auf Filter von RNA Northern Blot und von Proteinen Western Blot genannt.
Anwendungen
Im Bereich der Medizin dient das Western Blotting dem Nachweis diagnostisch interessanter Proteine, so zum Beispiel von Immunglobulinen, welche für das Vorliegen bestimmter Infektionskrankheiten typisch sein können..
Vorgehen
- Ein Proteingemisch wird mit Hilfe einer Gelelektrophoresetechnik in einer Trägermatrix (SDS-PAGE, native-PAGE, isoelektrische Fokussierung, usw.) entsprechend ihrer Größe oder Ladung nach aufgetrennt.
- Danach werden die getrennten Proteine auf ein Trägermaterial (Membranen aus Nitrocellulose, PVDF oder Nylon) durch ein elektrisches Feld oder kapillaren Aufstieg übertragen. (Proteintransfer, ugs. "Blotten" von engl. "blot" = Fleck, Klecks)
- Der Nachweis der gesuchten Proteine erfolgt durch spezifische Antikörper, die in einem zweiten Schritt mit radioaktiv markierten Antikörpern oder Enzym-Antikörper-Konjugaten gekoppelt werden.
- Bei radioaktiv markierten Zweitantikörpern erfolgt der Nachweis durch Autoradiographie auf Röntgenfilmen. Bei Enzym-Antikörper-Konjugaten wird durch das Enzym eine Farb- oder Chemilumineszenzreaktion katalysiert (Peroxidase katalysiert die Reaktion von Luminol mit Wasserstoffperoxid). Der Nachweis erfolgt dabei durch einen photographischen Film oder speziellen Scannern.
- Zusätzlich lassen sich die Proteine auf der Membran durch Proteinfärbung (Tusche, Coomassie-Brillant Blau, Ponceau S, Colloidales Gold, Amidoschwarz) sichtbar machen.