Ein Okazaki-Fragment nennt man in der Molekularbiologie einen während der DNA-Replikation entstehenden kurzen Abschnitt des Folgestrangs aus DNA und RNA. Benannt ist es nach dem Japaner Reiji Okazaki, der den Replikationsmechanismus 1965 vorschlug. Bei Prokaryoten ist ein solches Fragment 1000 bis 2000, bei Eukaryoten 100 bis 200 Nukleotide lang.
a: Elternstränge, b: Leitstrang, c: Folgestrang, d: Replikationsgabel, e: Primer, f: Okazaki-Fragment
Die Verdoppelung eines DNA-Moleküls erfolgt so, dass zunächst die beiden antiparallel verlaufenden Einzelstränge der Doppelhelix von bestimmten Proteinen entwindet werden, wobei zwei Replikationsgabeln entstehen, die bidirektional von einem Ursprung ausgehend sich im gesamten DNA-Molekül fortsetzen. Die Neubildung der DNA erfolgt in unmittelbarer Nähe der Gabeln und semikonservativ, d. h. an jedem der zwei ursprünglich vorhandenen Elternsträngen wird ein Tochterstrang mit komplementärer Basenabfolge gebildet.
Das für die Synthese der DNA zuständige Protein DNA-Polymerase III braucht als Starthilfe ein kurzes, Primer genanntes und an die zu kopierende DNA gebundenes RNA-Molekül, welches es dann um weitere Nukleotide, den Bausteinen der DNA, verlängert. Die Polymerase vermag nur in 5'–3' Richtung einen lückenlosen neuen Strang zu bilden. Den in Wanderungsrichtung der Replikationsgabel (im Bild nach links) kontinuierlich gebildeten Tochterstrang nennt man Leitstrang, den aufgrund der Enzymeigenschaften diskontinuierlich an dem anderen, in 3'–5'-Richtung verlaufenden Elternstrang gebildeten nennt man Folgestrang.
Der Folgestrang wird nahe der Gabel, von dem Primer ausgehend, bis zum Ende des entwindeten DNA-Abschnitts in 5'–3'-Richtung, aber entgegen der Bewegungsrichtung der Replikationsgabel synthetisiert; da die DNA sich nur mit endlicher Geschwindigkeit aufwickelt, ist der dabei entstehende Strang kurz. Die Gabel bewegt sich fort, und weitere Teile der DNA werden frei, an die eine Primase erneut einen Primer setzt. Von dort aus beginnt die Polymerase ein weiteres DNA-Teil anzuschließen, bis sie auf das 5'-Ende des zuvor gebildeten kurzen Fragments stößt usw. Diese repetitiv gebildeten kurzen Abschnitte aus DNA und RNA heissen Okazaki-Fragmente.
Ein weiteres Enzym, die DNA-Polymerase I, entfernt die Primer und füllt die Lücken zwischen den Fragmenten mit zusätzlichen Desoxynukleotiden wieder auf. Eine DNA-Ligase verknüpft die einzelnen Fragmente, sodass schließlich ein kompletter DNA-Strang, der Folgestrang, entsteht.