Photoactivated Localization Microscopy
Photoactivated Localization Microscopy (PALM) beziehungsweise Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) sind spezielle Methoden der Lichtmikroskopie, genauer der Fluoreszenzmikroskopie. Sie beruhen auf einem lichtgesteuerten Ein- und Ausschalten von Fluoreszenz in einzelnen Molekülen. Das Ein- und Ausschalten erfolgt dabei über einen gewissen Zeitraum hinweg, über den viele einzelne Bilder aufgenommen werden. Durch eine anschließende Computerberechnung lässt sich die Position einzelner Moleküle mit einer Auflösungen jenseits der von Ernst Abbe beschriebenen optischen Auflösungsgrenze bestimmen.
Die Technik wurde 2006 von zwei Gruppen parallel entwickelt und unterschiedlich bezeichnet. Eric Betzig und Kollegen am Howard Hughes Medical Institute nannten sie PALM, Xiaowei Zhuang und Kollegen an der Harvard University nannten sie (STORM). Die erzielte Auflösung wurde mit 2 bis 25 nm bzw. 20 nm angegeben. [1][2]
Funktionsprinzip
In der klassischen Fluoreszenzmikroskopie können fluoreszierende Moleküle, die zu nah beieinander liegen, nicht mehr aufgelöst werden: Sie erscheinen als eine einzige Struktur.
PALM umgeht dieses Problem, indem es sich die besonderen Eigenschaften von Photoactivatable Fluorescent Proteins (PA-FPs) zu Nutze macht. Diese speziellen Varianten des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) können durch Licht bestimmter Wellenlänge und Intensität gezielt aktiviert und deaktiviert werden. Wie andere GFPs auch können sie molekularbiologisch an solche Proteine fusioniert werden, deren Position in der Zelle untersucht werden soll.
Zunächst sind alle PA-FPs inaktiv, also nicht fluoreszent. Durch einen kurzen Lichtblitz von 405 nm Wellenlänge werden zufällig einige wenige PA-FPs aktiviert. Dadurch können sie mit der „Detektionswellenlänge“ von 561 nm zur Fluoreszenz angeregt und fotografiert werden. Bei fortschreitender Belichtung bleichen diese Fluoreszenzmoleküle aus, das heißt die Fähigkeit zur Fluoreszenz geht in diesem Molekül unwiederbringlich verloren. Dabei werden fortlaufend weitere Bilder gemacht. Die Versuchsbedingungen werden so gewählt, dass die Wahrscheinlichkeit, dass bei einem Aktivierungsblitz zwei dicht nebeneinander liegende Moleküle gleichzeitig aktiviert werden, sehr klein ist. Da zu dicht liegende fluoreszierende Moleküle nicht von einander unterschieden werden könnten, ist dies eine Voraussetzung für die hohe Auflösung im Nanometerbereich.
Ein nächster Lichtblitz aktiviert wieder zufällig einige PA-FPs und der Vorgang wiederholt sich. Nach sehr vielen Durchgängen sind alle PA-FPs ausgebleicht und fotografiert.
Die fluoreszierenden Moleküle erscheinen aufgrund der Beugung des Mikroskopes zunächst verschwommen. Durch einen mathematischen Algorithmus unter Anwendung der Punktspreizfunktion kann jedoch die genaue Position jedes Moleküls berechnet werden. Ein Computerprogramm führt dies für alle Teilbilder durch und erzeugt daraus das endgültige Bild.
Verbreitung und Alternativen
Mikroskope, die mit PALM arbeiten, befinden sich in der Entwicklungsphase und sind noch nicht kommerziell erhältlich. Sie stehen in Konkurrenz mit dem in Deutschland entwickelten STED-Mikroskop, bei dem es sich ebenfalls um ein Fluoreszenzmikroskop mit verbesserter lateraler Auflösung handelt. Ein großer Nachteil von PALM ist die sehr lange Akquisitionszeit (Aufnahmedauer) in der Größenordnung von Stunden bis Tagen. Ein Vorteil ist der im Vergleich zum STED Mikroskop geringere Preis. Die Aufrüstung eines klassischen Fluoreszenzmikroskopes mit PALM ist theoretisch denkbar.
Literatur
- ↑ E. Betzig et al.: Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. In: Science. Vol. 313, Nr. 5793, September 2006, S. 1642–1645, doi:10.1126/science.1127344.
- ↑ X. Zhuang et al.: Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). In: Nature Methods (published online). Band 3, September 2006, S. 793–796, doi:10.1038/nmeth929.