Agarose-Gelelektrophorese

Agarose-Gelelektrophorese ist eine molekularbiologische Methode, um Desoxyribonukleinsäure (DNS)-Stränge nach ihrer Größe zu trennen und um ihre Größe durch Vergleich mit Strängen bekannter Größe zu bestimmen. Diese Gelelektrophorese funktioniert wie ein Sieb für Moleküle; ein elektrisches Feld wird verwendet, um die negativ geladenen DNS-Moleküle durch die Gelmatrix zu ziehen, wobei die kleineren DNA-Moleküle sich schneller durch das Gel bewegen können.

Material

Für die Agarose-Gelelektrophorese werden benötigt:

• Die DNS, die nach ihrer Größe aufzutrennen ist.
• Eine DNS-Leiter, eine Mischung verschiedener DNS-Stränge bekannter Länge, mit der die DNS-Probe verglichen werden kann, um deren Größe zu bestimmen. DNS-Leiter sind kommerziell erhältlich.
• TBE-Puffer, 0.5×, pH 8.0
• EDTA, 0.5M, pH 8.0
• Agarose
• Ethidiumbromid (5.25 mg/ml in H₂O)
• Ein Farbmarker, z.B. ein niedermolekularer Farbstoff wie Bromphenol Blau, um den Fortschritt der Elektrophorese abschätzen zu können.
• Eine Gelkammer.
• Ein "Kamm" (normalerweise aus Teflon).

Vorbereitung

1. Herstellung einer 1% Agaroselösung in TBE; für kleine DNS-Fragmente bis zu 2%. Volumen 15-70 ml, je nach Größe des Gels.
2. Agarosegellösung kochen, normalerweise in der Mikrowelle.
3. Die Lösung bei Raumtemperatur bis auf ca. 60 °C abkühlen lassen, dabei stetig rühren.
4. 1 ml Ethidiumbromid pro 10 ml Gellösung dazugeben. Vorsicht: Ethidiumbromid ist mutagen!
5. Die Lösung rühren, bis sich das Ethidiumbromid gut verteilt hat, dann in die Gelkammer gießen.
6. Den Kamm auf einer Seite des Gels hineinstecken, ca. 5-10 mm vom Rand entfernt.
7. Wenn das Gel fest geworden ist, den Kamm entfernen. Die Löcher, die im Gel zurückbleiben, werden Slots genannt.
8. Das Gel in 0,5× TBE-Laufpuffer legen. Das Gel muss vollständig bedeckt sein. Die Slots müssen an der negativen Elektrode der Kammer zu liegen kommen.
9. Den Farbmarker zu den DNS-Proben hinzugeben. DNS-Leiter enthält für gewöhnlich schon Farbmarker.

Prozedur

DNS-Leiter und -Proben in jeweils einen Slot spritzen (bis zu 25 µl). Elektrische Spannung anlegen, normalerweise 100 Volt für 30 Minuten mit einem 15 ml-Gel. Wenn die "Farbfront" das Gel verlässt, Elektrophorese beenden.

Schematische Darstellung der Elektrophorese

1. Das Agarosegel mit 3 Slots (S).
2. Einspritzen von DNS-Leiter in den ersten Slot.
3. DNS-Leiter ist injiziert. Proben 2 und drei werden eingespritzt.
4. Eine Spannung wird angelegt. Die DNS wandert zur positiv gelagenen Anode, wegen der Phosphatreste im "Rückgrat" der DNS.
5. Kleine DNS-Fragmente wandern schnell, große langsam durch das Gel. Die DNS ist währenddessen normalerweise nicht sichtbar. Daher wird der Fortschritt an der Farbfront abgelesen, die sich schneller als selbst kleinste DNS-Fragmente durch das Gel bewegt.
6. Die Farbfront hat das Ende des Gels erreicht, die Elektrophorese ist komplett.

Das Gel kann unter einer UV-Lampe betrachtet werden. Ethidiumbromid, das sich in die DNS eingelagert hat, fluoresziert im ultravioletten Licht (Gesichtsschutz tragen!). Eine DNS-Bande kann aus dem Gel ausgeschnitten und die DNS zur weiteren Verwendung gereinigt werden.

Siehe auch: SDS-PAGE