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Unter dem Akronym SELEX (en: Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment, zu deutsch: Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) versteht man in der Molekularbiologie ein kombinatorisches Verfahren zur evolutionären Entwicklung von Oligonukleotid-Strängen, beispielsweise einsträngiger DNA oder RNA, die als Liganden spezifisch an ausgewählte Targets binden können[1][2].
Das Verfahren wird gelegentlich auch als in vitro Selektion oder in vitro Evolution bezeichnet.
Die mit Hilfe der SELEX gewonnenen Oligonukleotid-Sequenzen werden Aptamere genannt. SELEX© ist ein eingetragenes Warenzeichen der Firma Gilead Sciences.

Das Verfahren

Zu Beginn des Verfahrens steht die Synthese einer sehr großen Anzahl von Oligonukleotiden, die so genannte Molekülbibliothek, auch Molekülpool genannt. Aus diesem bis zu 1016 unterschiedlichen Molekülen bestehenden Pool werden die Moleküle mit den gewünschten Eigenschaften durch gezielte Vermehrung herausisoliert (separiert). Die verschiedenen Moleküle konkurrieren miteinander und die Moleküle, welche die gestellte Anforderung bzw. Aufgabe am Besten erfüllen werden selektiert und weiter vermehrt. Anschließend werden die ausgewählten und vermehrten Moleküle erneut einer Selektion, unter variierten und meist verschärften Bedingungen, unterzogen. Danach werden wiederum nur die Besten Moleküle erneut gezielt vermehrt.
Durch den wiederholten Kreislauf von

  • Selektion bindender RNA-Moleküle, (Selektion)
  • Abtrennung nicht bindender Sequenzen, (Separation)
  • sowie enzymatischer Amplifikation der mit dem Zielmolekül interagierenden RNA-Liganden (Amplifikation)

erhält man üblicherweise Sequenzen, die sehr spezifisch und hochaffin an gewünschten Liganden binden.[3] Diese evolutionäre Vorgehensweise ist besonders leicht mit Molekülen wie DNA oder RNA durchzuführen, da sie mit Hilfe der PCR relativ einfach vermehrbar sind. Der Kreislauf Selektion - Separation - Amplifikation wird bis zu zwölfmal wiederholt.

Die DNA / RNA Bibliothek

Die einzelsträngige DNA-Ausgangsbibliothek (ssDNA) wird meist chemische DNA-Synthesen mittels automatisierter Festphasensynthese hergestellt. Der durch PCR hergestellte doppelsträngige DNA- und in RNA umgeschriebene Pool kann nun im nächsten Schritt des Selektionsprozesses mit dem gewünschten Zielmolekül unter sorgfältig ausgewählten Bedingungen inkubiert werden, was im immobilisierten Zustand oder in Lösung stattfinden kann. Durch unterschiedliche Waschschritte werden ungebundene von gebundenen Sequenzen abgeschieden. Danach erfolgt eine reverse Transcription und PCR, woraus ein Pool von RNA-Molekülen mit verbesserten Bindungseigenschaften zum Liganden resultiert. Mit diesem Schritt schließt sich der Kreislauf und wird nun für gewöhnlich acht bis zwölfmal wiederholt, bis ein gewünschtes Aptamer erhalten wird, oder nur wenig verschiedene Sequenzen angereichert sind. Durch Klonierung und Sequenzierung resultieren nach Abschluss der systematischen Evolution monoklonale Aptamere. Als mögliche Zielmoleküle (Targets) kommen verschiedenste Moleküle wie einfache organische Verbindungen, Proteine oder ganze Zellen in Frage.[3]

Die Ausgangsbibliothek enthält für gewöhnlich einen Bereich von 20 – 220 randomisierten Nukleotiden[4]. An den Enden befinden sich konstante Primerbindende 3'- bzw. 5'-Sequenzen. Im konstanten Bereich liegt meist eine Promotorsequenz, die für die in vitro-Transkription der RNA unerlässlich ist[5].

Zwischen den beiden konstanten Enden befindet sich die eigentlich Zufallssequenz aus n-Nukleotiden, was 4n verschiedene mögliche Sequenzen ergibt. Rein rechnerisch ergibt sich aus einer Zufallssequenz mit n Nukleotid-Elementen:

  • n = 25 eine Bibliothek aus ca. 1015 Sequenzen,
  • n = 50 eine Bibliothek aus ca. 1030 Sequenzen,
  • n = 75 eine Bibliothek aus ca. 1045 Sequenzen,
  • n = 100 eine Oligonukleotid-Bank aus ca. 1060 Sequenzen.[6]

Ein Mol, das heißt 6,022*1023 Moleküle eines 25mers wiegen ca. 7,5kg. Um statistisch ein Molekül von jeder möglichen Variante zu haben, benötigt man 75µg Oligonukleotid. Für eine 50-fache statistische Deckung benötigt man lediglich 3,75mg Oligonukleotid.
Völlig anders dagegen ist die Situation bei den längerkettigen Sequenzen. Für eine einfache statistische Deckung benötigt man, nach Abzug der Primer, beim 40mer 120kg, beim 50mer 1,5*108kg und beim 100mer 3*1038kg.[6]

Der Nachteil langer Zufallssequenzen ist, dass je länger die Zufallssequenz wird, der Ausschnitt der möglichen Sequenzen kleiner wird, den eine Probe im mg-Maßstab repräsentiert. Der Vorteil langer Zufallssequenzen ist dagegen, dass ein einziges 100mer bereits 75 verschiedene 25mer Sequenzen bzw. 50 verschiedene 50mer Sequenzen enthält. Die kann das Selektionsverfahren deutlich beschleunigen.[6]


Selektionsverfahren

Separationsverfahren

Amplifikation

[7]

Historie

Die SELEX-Methode wurde 1990 zeitgleich von Larry Gold[2] und Andrew E. Ellington[1] entwickelt. Beide Ansätze basieren auf dem Prinzip der selektiven Erkennung von Zielstrukturen, vermittelt durch die 3-dimensionale Form von einzelsträngigen Nukleinsäuren. Gold verwendete dabei einstränige DNA (single strand DNA, ssDNA), Ellington dagegen RNA mit definierter Oberflächenstruktur.[7]

Hintergrund

Die Selektion neuer Enzyme auf RNA- und DNA-Basis, den sogenannten Ribozymen, ist in den Fokus der Forschung gerückt. Die katalytisch aktive RNA, die sich in spezifische dreidimensionale Formen faltet, kann wie ein auf Proteinen basierendes Enzym Reaktionen katalysieren. Zudem können die Ribozyme wie ein Antikörper hochspezifisch kleine Moleküle oder Proteine molekular binden.
Die Herstellung dieser Aptamere genannten, hochspezifischen Rezeptoren auf DNA- oder RNA-Basis, die an medizinisch relevante Targets binden können, ist das Ziel von SELEX.[8]

Der erste Schritt beinhaltet die Erzeugung einer Bibliothek. Hierzu wird ein DNA-Synthesizer angewiesen nicht ein Nukleotid an einer bestimmten Stelle zu kuppeln, sondern eine Mischung aus allen vier Phosphoramiditbausteinen. Die randomisierte Sequenz wird in der Mitte zwischen bekannten Sequenzen hergestellt, die für die Primererkennung notwendig sind.

RNA- oder DNA-Aptamere

Einzelstrang-DNA-basierte (ssDNA) Aptamere sind nach Ellington[9] wegen ihrer höheren Stabilität bei gleicher Spezifität besser geeignet als RNA-basierte Aptamere.[6]

Molekülmodifikationen

Die Verwendung von 2’-Fluoro- oder 2’-Amino-Mononukleotid-Triphosphat modifizierten RNA-Bibliotheken ermöglicht die Gewinnung von [Ribonuklease]]-resistenten Aptameren[10]. Derart modifizierte Aptamere haben das Potenzial, auch in biologischen Flüssigkeiten (Blut, Urin) als Sonde zu fungieren[11].[7]

Vorteile der SELEX

Die Entwicklungs- und Herstellungskosten für Biosensoren auf Aptamerbasis werden in der Literatur als erheblich niedriger eingeschätzt, als die auf Proteinbasis wie z.B. Antikörper. 


For a randomly generated region of length n, the number of possible sequences in the library is 4n. The sequences in the library are exposed to the target ligand - which may be a protein or small organic compound - and those that do not bind the target even weakly are removed, usually by affinity chromatography. The bound sequences are eluted and amplified by RT-PCR to prepare for subsequent rounds of selection in which the stringency of the elution conditions is increased to identify the tightest-binding sequences. An advancement on the original method allows an RNA library to omit the constant primer regions, which can be difficult to remove after the selection process because they stabilize secondary structures that are unstable when formed by the random region alone.[12]


Im November 2001 erwarb das US Unternehmen Archemix die weltweite exklusive Lizenz für ein breites Portfolio von Patenten auf Aptamerbasis von Gilead Sciences für 17,5 M US$.[13][14]

Die Spiegelmer-Technologie hat starke Auswirkungen für die Entwicklung von Medikamenten, da die Spiegelmere gegenüber körpereigenen Enzymen stabil sind und als wirksame und sehr spezifische Antagonisten für eine Reihe von pharmakologischen Schlüsselmolekülen dienen können.[13]


The technique has been used to evolve aptamers of extremely high binding affinity to a variety of target ligands, including small molecules such as ATP[15] and adenosine[16][17] and proteins such as prions[18] and vascular endothelial growth factor (VEGF).[19] Clinical uses of the technique are suggested by aptamers that bind tumor markers[20] and clinical trials are underway for a VEGF-binding aptamer trade-named Macugen in treating macular degeneration.[19][21]

One caution advanced in relation to the method emphasizes that selection for extremely high, sub-nanomolar binding affinities may not in fact improve specificity for the target molecule.[22] Off-target binding to related molecules could have significant clinical effects.

References

  1. ↑ a b Ellington AD et.al., in Nature, 346/1990, S.818-822
  2. ↑ a b Tuerk C et.al., Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, in Science, 249/1990, S.505–510.
  3. ↑ a b Kainz S, Selektion und Charakterisierung von Aptameren, spezifisch für das Virus der Infektiösen Bursitis, Dissertation, 2005
  4. ↑ Bartel DP, Szostak JW, Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences, in Science, 261/1993, S.1411-1418
  5. ↑ Beaudry AA, Joyce GF, Directed evolution of an RNA enzyme, in Science, 257/1992, S.635-641
  6. ↑ a b c d Landesumweltamt NRW, 2006: Antibiotika, Resistenzen und Bakterien in Kläranlagen
  7. ↑ a b c Blank M, Systematische Evolution von DNA-Aptameren zur Charakterisierung und Diagnostik von pathologisch veränderten Endothelzellen in Tumoren und entzündlichen Regionen des Rattenhirns, Dissertation, 2002
  8. ↑ Uni Marbug: Anwendung der PCR in der in vitro random selection
  9. ↑ Ellington AD, Szostak JW, Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligand-binding structures, in Nature, 355/1992, S.850-852
  10. ↑ Eaton B et. al., in Annu. Rev. Biochem. 64/1994, S.837-863
  11. ↑ Pieken W, in Science, 253/1991, S.314-317
  12. ↑ Jarosch F, Buchner K, Klussmann S. (2006). In vitro selection using a dual RNA library that allows primerless selection. Nucleic Acids Res 34(12):e86.
  13. ↑ a b NOXXON Pharma AG erwirbt SELEX(TM)-Sublizenz für spiegelbildliche nukleinsäuren von Archemix
  14. ↑ Gilead Licenses Rights Under Its Selex and Aptamer Patent Estate to Archemix
  15. ↑ Dieckmann T, Suzuki E, Nakamura GK, Feigon J. (1996). Solution structure of an ATP-binding RNA aptamer reveals a novel fold. RNA 2(7):628-40.
  16. ↑ Huizenga DE, Szostak JW. (1995). A DNA aptamer that binds adenosine and ATP. Biochemistry 34(2):656-65.
  17. ↑ Burke DH, Gold L. (1997). RNA aptamers to the adenosine moiety of S-adenosyl methionine: structural inferences from variations on a theme and the reproducibility of SELEX. Nucleic Acids Res 25(10):2020-4.
  18. ↑ Mercey R, Lantier I, Maurel MC, Grosclaude J, Lantier F, Marc D. (2006). Fast, reversible interaction of prion protein with RNA aptamers containing specific sequence patterns. Arch Virol 151(11):2197-214.
  19. ↑ a b Ulrich H, Trujillo CA, Nery AA, Alves JM, Majumder P, Resende RR, Martins AH. (2006). DNA and RNA aptamers: from tools for basic research towards therapeutic applications. Comb Chem High Throughput Screen 9(8):619-32.
  20. ↑ Ferreira CS, Matthews CS, Missailidis S. (2006). DNA aptamers that bind to MUC1 tumour marker: design and characterization of MUC1-binding single-stranded DNA aptamers. Tumour Biol 27(6):289-301.
  21. ↑ Vavvas D, D'Amico DJ. (2006). Pegaptanib (Macugen): treating neovascular age-related macular degeneration and current role in clinical practice. Ophthalmol Clin North Am. 19(3):353-60.
  22. ↑ Carothers JM, Oestreich SC, Szostak JW. (2006). Aptamers selected for higher-affinity binding are not more specific for the target ligand. J Am Chem Soc 128(24):7929-37.

Literatur

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