SDS-PAGE (Abkürzung für engl. sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) ist eine Variante der Polyacrylamid-Gelelektrophorese, einer analytischen Methode der Biochemie zur Trennung von Molekülen im elektrischen Feld.
SDS-PAGE wird in der Analyse von Proteinen verwendet. Als Trennmedium bei dieser Art der Elektrophorese dient ein Gel auf Polyacrylamidbasis. Zusätzlich kommt SDS (Natriumdodecylsulfat) zum Einsatz. Dieses anionische Tensid (Detergenz) überdeckt die Eigenladungen von Proteinen. Pro 1 g Protein binden ungefähr 1,4 g SDS, so dass die Proteine eine konstante Ladungsverteilung aufweisen.
Bei der Probenvorbereitung wird SDS im Überschuss zu den Proteinen hinzugegeben und die Probe anschließend auf 95 °C erhitzt, um Sekundär- und Tertiärstrukturen durch das Unterbrechen von Wasserstoffbrücken und das Strecken der Moleküle aufzubrechen. Optional können Disulfidbrücken durch Reduktion gespalten werden. Dazu werden reduzierende Thiolverbindungen wie β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT) oder Dithioerythrit (DTE) dem Probenpuffer zugesetzt. Am Ende dieser Präparation weisen die mit SDS beladenden Proteine eine ellipsoide Form auf. Durch den starken Denaturierungseffekt können in der Regel keine Proteine mit Quartärstruktur bestimmt werden. Einzig die sogenannten SDS-resistenten Proteinkomplexe sind auch in Gegenwart von SDS (bei Raumtemperatur) stabil. Dieses Phänomen wird als kinetische Stabilität bezeichnet und meint die große Menge an Aktivierungsenergie, die notwendig ist, um die Komplexe zu denaturieren. Das Gegenteil thermodynamische Stabilität bedeutet, dass das native, vollständig gefaltete Protein mit seiner denaturierten Form in einem chemischen Gleichgewicht steht. Kinetisch stabile Proteinkomplexe zeichnen sich neben der SDS-Resistenz auch noch durch Stabilität gegen Proteasen und eine große Halbwertszeit aus.[1]
Zur Auftrennung werden die denaturierten Proben auf ein Gel aus Polyacrylamid geladen, welches in geeignete Elektrolyten eingelegt ist. Danach wird eine elektrische Spannung angelegt, die eine Migration der negativ geladenen Proben durch das Gel bewirkt. Das Gel wirkt dabei wie ein Sieb. Kleine Proteine wandern relativ leicht durch die Maschen des Gels, während große Proteine eher zurückgehalten werden und dadurch langsamer durch das Gel wandern. Am Ende des Vorganges sind alle Proteine nach Größe sortiert und können durch weitere Verfahren (Färbungen wie z.B. Coomassiefärbung oder Silberfärbung, Immunologische Nachweise wie z.B. beim Western Blot) sichtbar gemacht werden. Zusätzlich zu den Proben wird meistens ein Größenmarker auf das Gel geladen. Dieser besteht aus Proteinen mit bekannter Größe und ermöglicht dadurch die Abschätzung der Größe von Proteinen in den eigentlichen Proben.
Als Elektrolyt wird häufig ein SDS-haltiges TRIS-Glycin-Puffersystem eingesetzt, da hiermit eine sehr gute Trennung der einzelnen Proteine voneinander erzielt werden kann. Dieses System wurde ursprünglich von Ulrich Laemmli entwickelt.[2] Aufgrund der – beiläufigen – Beschreibung des von ihm entwickelten Verfahrens ist jene Publikation das am häufigsten zitierte Paper eines einzelnen Autoren, und das häufigste nach der von Lowry et al. überhaupt.[3] Zur Trennung von kleinen Proteinen und Peptiden eignet sich besser das TRIS-Tricin-Puffersystem von H. Schägger.[4]
Moderne Gelsysteme verwenden die Puffersubstanz BisTris mit einen pH-Wert von 6,4 sowohl im Sammel- als auch im Trenngel. Der niedrige pH-Wert verhindert den Zerfall des Polyacrylamids und macht die Gele über lange Zeit lagerfähig. Zusätzlich besitzt dieses Gelsystem einen sehr großen Auftrennungsbereich, der zusätzlich durch Verwendung von MES oder MOPS im Laufpuffer variieren werden kann.
Literatur
- ↑ Manning, M. & Colón, W. (2004): Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. In: Biochemistry. Bd. 43, S. 11248-11254. PMID 15366934
- ↑ Laemmli, U.K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. In: Nature. Bd. 227, S. 680-685. PMID 5432063 doi:10.1038/227680a0
- ↑ www.nzzfolio.ch: Interview mit Ulrich Lämmli. NZZ Folio, 11/2005.
- ↑ Schägger, H. & von Jagow G. (1987): Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. Bd. 166, S. 368-379. PMID 2449095 doi:10.1016/0003-2697(87)90587-2
Siehe auch
Weblinks
- OpenWetWare: Protokol für BisTris SDS-PAGE