Mathilde von Tuszien (*1046; † 15. Juli 1115) war Markgräfin auf der Burg Canossa im toskanischen Apennin, 18 km südlich von Reggio nell' Emilia. Hier trat im Februar 1077 König Heinrich IV. Papst Gregor VII. entgegen, um die Lösung vom Kirchenbann zu erreichen.
Ihr Vater war Markgraf Bonifaz von der Toskana, Fürst von Reggio nell' Emilia, Modena, Mantua, Brescia, und Ferrara, also eines großen Gebietes zu beiden Seiten des Apennin, dessen Schwerpunkt in der Toskana lag. Ihre Mutter war Beatrix von Lothringen, eine Tochter des Friedrich II. von Lothringen und der Mathilde von Schwaben. Sie war das jüngste Kind, ihr Vater wurde 1052 ermordet, ihre älteren Geschwistern starben kurz darauf.
Beatrix heiratete ihren Cousin Gottfried den Bärtigen, der Fürst von Lothringen war, bis er gegen Kaiser Heinrich III. rebellierte. Sein Bruder wurde Papst Stephan IX., die folgenden Päpste Alexander II. und Nikolaus II. stammten aus der Toskana. Beatrix und Gottfried schlugen sich im Investiturstreit auf die päpstliche Seite.
Mathilde wurde verheiratet mit dem Sohn ihres Stiefvaters, Gottfried IV., genannt der Bucklige (†1076), der nach dem Tod seines Vaters 1069 die Regierung in Lothringen antrat und die ihm entfremdete Mathilde in der Toskana zurückließ. Nach dem Tod ihres Mannes und ihrer Mutter im selben Jahr regierte sie ihre weitläufigen Besitzungen in der Toskana allein von der Burg Canossa aus, die heute eine Ruine ist.
Dorthin zog Heinrich IV. von Speyer mit seiner Gemahlin als Büßer, wo er auf den Papst traf. Vom 25. bis zum 27. Januar 1077 harrte er vor den Toren der Burg barfuß im Schnee aus und am 28. Januar hob Gregor VII., hauptsächlich auf Vermittlung der Mathilde von Tuszien, den Kirchenbann auf. Die Absetzung allerdings nahm der Papst nicht zurück und so wurde am 15. März Rudolf von Schwaben von den deutschen Fürsten zum Gegenkönig gewählt.
Der Gang nach Canossa war ein wichtiger Meilenstein im Investiturstreit. Auch weiterhin blieb Mathilde die wichtigste Stütze der Päpste. Um 1090 heiratete sie Welf V. von Bayern aus dem Geschlecht der Welfen. Dies veranlaßte den Sohn Heinrichs IV., Heinrich V., nach Italien zurückzukehren. Mathilde mußte in die Berge fliehen, Heinrich konnte sich jedoch nicht durchsetzen.
Nach ihrem Tod 1114 vererbte die kinderlose Mathilde ihre Besitzungen der Kirche, die jedoch Kaiser Heinrich als Reichsgebiet beanspruchte. Er kam deswegen in Konflikt mit Papst Paschalis II.
Im 17. Jahrhundert wurden ihre Gebeine in den Petersdom übertragen.
Den Gang nach Canossa behandelt Luigi Pirandellos Stück Heinrich IV.