Maria von Spanien (29. Juni 1482; † 7. März 1517) war eine Prinzessin von Spanien und als zweite Ehefrau Emanuel des Glücklichen von 1500 bis zu ihrem Tode Königin von Portugal (als Gemahlin, nicht als Herrscherin eigenen Rechts).
Maria war eine Tochter der katholischen Könige, also von Königin Elisabeth (Isabella) I. von Kastilien und König Ferdinand II. von Aragonien.
Sie hatte vier Geschwister, darunter Johanna die Wahnsinnige von Spanien, und Katharina von Aragon, die Ehefrau König Heinrich VIII. von England, deren vom Papst nicht sanktionierte Scheidung die Abspaltung der anglikanischen von der katholischen Kirche zur Folge hatte.
Vor ihr war bereits ihre ältere Schwester Elisabeth von Spanien mit König Emanuel I. verheiratet worden, diese starb aber 1498 nach der Geburt ihres ersten Sohnes. 1500 heiratete dann den Witwer ihrer Schwester, um die dynastischen Beziehungen zwischen den königlichen Familien Portugals und Spaniens aufrechtzuerhalten.
Mit Emanuel I. hatte sie zehn Kinder, darunter die portugiesischen Könige Johann III. und Heinrich I. und Isabella, die Ehefrau des römisch-deutschen Kaisers Karl V.
Maria von Spanien ist nicht zu verwechseln mit Maria (Theresia) von Spanien, der Frau des französischen Sonnenkönigs Ludwig XIV.
Siehe auch: Liste der Königinnen Portugals, Liste der Könige Portugals, Portugal unter dem Hause Avis, Geschichte Portugals, Zeittafel der Geschichte Portugals.