EcoRI ist ein Enzym aus der Familie der Nukleasen. Es ist die erste aus Escherichia-coli-Bakterien des Stamms R gewonnene Nuklease. Es findet insbesondere in der Molekularbiologie Anwendung als Restriktionsenzym. Ein Komplex aus zwei Molekülen EcoRI (Homodimer) schneidet doppelsträngige DNA innerhalb der palindromischen Erkennungssequenz GAATTC unter Bildung eines 5'-Überhangs wie folgt:
5'-G AATTC-3' 3'-CTTAA G-5'
Diese Ausbildung eines 4-Basen-Überhangs ("sticky ends") wird in der Molekularbiologie bei der Ligation von DNA-Fragmenten ausgenutzt. Unter bestimmten Bedingungen zeigt EcoRI eine verminderte Selektivität für die GAATTC-Erkennungssequenz (Star-Aktivität).