Phenylmethylsulfonylfluorid, auch α-Toluolsulfonylfluorid oder PMSF ist eine chemische Verbindung, die vor allem in der Molekularbiologie Anwendung findet. Die Summenformel lautet C7H7FO2S, das Molekulargewicht beträgt 174,2 g/mol.
PMSF inhibiert zahlreiche Proteasen, vor allem Serin-Proteasen (Chymotrypsin, Trypsin und Thrombin) sowie die Dystin-Protease Papain. Es wird deshalb (oft zusammen mit anderen Proteasehemmern) verwendet, um Proteinabbau beim Aufschluss zuvor kultivierter Zellen zu verhindern. Stammlösungen werden meist in Ethanol hergestellt, PMSF löst sich aber ebenfalls gut in Isopropanol und Methanol. Die Lagerung der Lösungen erfolgt kühl oder bei -20°C und abgedunkelt. Wässrige Lösungen sind instabil. Hohe Salzkonzentrationen schränken die inhibitorische Wirkung ein. Die Substanz ist giftig und steht im Verdacht, Krebs zu erzeugen.