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Erythropoetin

ist ein Glykoprotein-Hormon
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Erythropoetin (Synonyme: EPO, Erythropoietin, Epoetin) ist ein Glykoprotein-Hormon, das als Wachstumsfaktor für die Bildung roter Blutkörperchen (Erythrozyten) während der Hämatopoese von entscheidender Rolle ist.

Herkunft und Wirkung

Im Menschen wird das EPO vorwiegend in der Niere durch die Endothelzellen der peritubulären Kapillaren und in deutlich geringeren Mengen auch durch die Hepatozyten der Leber gebildet. Zudem konnte eine Syntheseaktivität im Gehirn, im Uterus, in Hoden und in der Milz nachgewiesen werden. Das EPO-Gen im Menschen befindet sich auf dem Chromosom 7 (Position 7q21-7q22). Die Synthese wird stimuliert durch eine verminderte Sauerstoffsättigung des Blutes in den Nierenarterien. Die Serumkonzentration des Hormons im gesunden Menschen liegt bei bis zu 19 mU/mL. Im Knochenmark bindet EPO an den transmembranen Erythropoetin-Rezeptor der Erythroblasten. Der Rezeptor (EpoR) gehört zur Familie der Cytokin-Rezeptoren, deren strukturelle Gemeinsamkeiten in zwei oder mehr immunglobulin-ähnlichen Domänen, vier gleichangeordneten Cystein-Resten und der extrazellulären Sequenz WSXWS bestehen. Die Bindung von EPO führt zu einer Homodimerisierung des Rezeptors, welche wiederum via Transphosphorilierung das rezeptorgekoppelte Enzym Janus Kinase 2 aktiviert. Dabei werden spezifische, intrazellulär rezeptorassoziierte Tyrosin-Reste phosporiliert und dienen hierdurch als Kopplungsstation für das Signaltransduktionsprotein STAT5, wodurch verschiedene Signaltransduktionskaskaden in Gang gesetzt werden. Dies führt zur Teilung der Progenitorzellen, die schließlich zu Erythrozyten ausdifferenzieren. So werden ca. 200 Milliarden Erythrozyten pro Tag gebildet. Akute und chronische Insuffizienzen infolge degenerativer Erkrankungen der Niere führen zu verminderten EPO-Bildung und damit zur renalen Anämie.
Die Aufgabe von EPO in vivo ist nicht allein auf die Bildung neuer Erythrozyten beschränkt. Immuncytochemische Hybridisierungsuntersuchungen haben gezeigt, dass EpoR in den unterschiedlichsten somatischen Zellen zu finden ist. Dazu gehören Neurone, Astrozyten, Mikroglia- und Herzmuskelzellen. EPO/EpoR-Interaktionen wurden in den verschiedensten nicht-eryhtroiden Geweben in Zusammenhang mit Zellteilungsvorgängen, Chemotaxis, Angiogenese, Aktivierung intrazellulären Calciums und Apoptosehemmung nachgewiesen. Spezifische EPO-Bindungsstellen wurden im Hippocampus gefunden, einem Gehirnbereich, der sehr anfällig ist für durch hypoxische Ischämien verursachte Degenerationen. Aufgrund dessen wird ein protektiver Effekt von EPO gegen Ischämien postuliert.

Literatur

  • Watkins P.C. et al. (1986), Regional assignment of the erythropoietin gene to human chromosome region 7pter-q22. Cytogenet Cell Genet 42: 214-218
  • Watowich S.S. (1999), Activation of erythropoietin signaling by receptor dimerization., Int J Biochem Cell Biol 31: 1075-1088.
  • Lapplin T.R. et al. (2002), EPO's alter ego: erythropoietin has multiple actions. Stem Cells 20: 485-492.


Datei:EPO.jpg
Schematische Darstellung des EPO-Moleküls

Strukturelle Eigenschaften

Das EPO-Gen (5,4 kb, 5 Exons und 4 Introns) codiert ein Pro-EPO-Protein mit 193 Aminosäureresten. Bei der posttranslationalen Modifikation wird N-terminal ein Peptid mit 27 Aminosäureresten sowie der danach verbleibende C-terminale Asparaginrest durch eine intrazelluläre Carboxypeptidase abgespalten. Chemisch ist humanes EPO ein saures, unverzweigtes Polypeptid aus 165 Aminosäure-Monomeren und einem Molekulargewicht von ca. 34 kDa. Der Kohlenhydratanteil, der etwa 40 % der Molekülmasse beträgt, besteht aus einer O-glykosidisch (Ser 126) und drei N-glykosidisch (Asn 24, Asn 38 und Asn 83) gebundenen Zuckerseitenketten. Die Seitenketten ihrerseits setzen sich aus den Monosacchariden Mannose, Galaktose, Fucose, N-Acteylglucosamin, N-Acetylgalactosamin und N-Acetylneuraminsäure zusammen. Letztere, auch unter dem Trivialnamen Sialinsäuren bekannt, sind entscheidend für die biologische Aktivität des Glykoproteins: Je höher der Sialylierungsgrad, desto höher ist die Aktivität und Serumhalbwertszeit des Hormons. Die Tertiärstruktur besteht aus vier antiparallelen α-Helices inklusiver benachbarter Schleifen. Natives EPO tritt in drei Varianten auf: Alpha, Beta und Asialo. Die asialylierten Isoformen, bei denen die endständigen Sialinsäuren entfernt sind, werden unmittelbar in der Leber abgereichert und sind somit wirkungslos. Funktionale Isoformen werden nach und nach durch Körperzellen, die den EPO-Rezeptor tragen, abgebaut. Dabei werden die EPO-Moleküle durch eine rezeptorvermittelte Endocytose in Lysosomen internalisiert und dort zerlegt.

Literatur

  • Recny M.A. et al. (1987), Structural characterization of natural human urinary and recombinant DNA-derived erythropoietin. J Biol Chem 262: 17156-17163

EPO als Therapeutikum

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Persönlichkeiten der EPO-Forschung

Forschungsgeschichte

Bereits 1863 erkannte der französische Arzt Denis Jourdanet (* 1815, † 1892) indirekt den Zusammenhang zwischen erniedrigtem Sauerstoffpartialdruck und Erhöhung der Erythrozytenzahl, als er hämatokritische Untersuchungen an Personen durchführte, die sich längere Zeit in alpinen Höhenlagen aufgehalten hatten. Den direkten Zusammenhang stellte Friedrich Miescher 1893 her. Im Jahr 1906 wurde durch den Franzosen Paul Carnot (* 1869, † 1957) und seine Mitarbeiterin Catherine Deflandere erstmals die Hypothese aufgestellt, dass die Blutbildung durch einen humoralen Faktor geregelt wird. Die beiden finnischen Nephrologen Eva Bonsdorff (* 1918) und Eeva Jalavisto (* 1909, † 1966) gaben schließlich 1948 diesem Faktor den Namen Erythropoetin, kurz EPO.
EPO selbst wurde 1953 durch Allan Jacob Erslev entdeckt und beschrieben. Zur Schlüsselfigur der weiteren EPO-Forschung wurde jedoch Eugene Goldwasser (* 1922). 1954 bestätigten er und seine Arbeitsgruppe von der University of Chicago die Arbeiten Erslevs durch eigene Ergebnisse. Goldwasser und sein Mitarbeiter Leon Orris Jacobson (*1911, † 1992) konnten 1957 indirekt nachweisen, dass EPO in der Niere gebildet wird. Die erstmalige Isolierung und Reinigung von humanem EPO aus Urin gelang besagter Arbeitsgruppe 1977. 1983 gelang Fue-Kuen Lin (* 1941), einem Mitarbeiter bei Amgen, die Isolierung des humanen EPO-Gens (US-Patent 4,703,008). 1984 wurde erstmals von einer erfolgreichen Klonierung und Expression eines rekombinanten EPO (rEPO) in Escherichia coli durch Sylvia Lee-Huang vom New York University Medical Center berichtet, 1985 gelang dies schließlich erstmal in Säugetierzellen.

Literatur

  • Jourdanet D. (1863), De l´anemie des altitudes et de l´anemie en general dans ses rapports avec la pression del l´atmosphere. Balliere, Paris.
  • Carnot P., Deflandre C. (1906), Sur l´activité hémopoiétique du sérum au cours de la régénération du sang. C R Acad Sci 143: 384-386.
  • Bonsdorff E., Jalavisto E. (1948), A humoral mechanism in anoxic erythrocytosis. Acta Physiol Scand 16: 150-170.
  • Erslev A. (1953), Humoral regulation of red cell production. Blood 8: 349-357.
  • Jacobson L.O. et al. (1957), Role of the kidney in erythropoiesis. Nature 179: 633-634.
  • Miyake T., Kung C.K., Goldwasser E. (1977), Purification of human erythropoietin. J Biol Chem 252: 5558-5564.
  • Lee-Huang S. (1984), Cloning and expression of human erythropoietin cDNA in Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81: 2708-2712.
  • Lin F.K. et al. (1985), Cloning and expression of the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci USA 82: 7580-7584.
  • Jacobs K. et al. (1985), Isolation and characterization of genomic and cDNA clones of human erythropoietin. Nature 313: 806-810.
  • Lin F.K. (1987), DNA sequences encoding erythropoietin. US-Patent 4,703,008.


EPO-Präparate der ersten Generation

  • Das US-amerikanische Biotechnologieunternehmen Amgen brachte 1989 das erste rekombinante EPO-Präparat (Epogen®, Epoetin α) auf den Markt. In klinischen Studien der Phasen I und II konnte bereits ab 1986 an der University of Washington in Seattle nachgewiesen werden, dass die Therapie von Anämien mit rekombinantem EPO bei Krebs- und Nierenpatienten wesentlich nebenwirkungsärmer ist als Behandlungen mit Bluttransfusionen. Die patentrechtliche Lage erlaubt Amgen die Exklusivvermarktung von EPO-Präparaten in den USA bis ins Jahr 2015. Amgens Lizenznehmer in Japan ist der Brauereikonzern Kirin, dessen Pharmasparte die Epoetin α-Variante seit 2001 unter dem Handelsnahmen ESPO® vertreibt.
  • Der US-amerikanische Pharmakonzern Johnson & Johnson entwickelte unter der Amgen-Lizenz ein Epoetin α, das unter den Handelsnamen Procrit® innerhalb und Eprex® außerhalb der USA erhältlich ist. In Europa wird das Präparat unter dem Handelsnamen Erypo® durch Janssen Cilag (Ortho Biotech), einer Tochtergesellschaft von Johnson & Johnson, vertrieben. Weitere Handelsnamen für den Vertrieb in Italien sind Epoxitin® und Globuren®. In Spanien und Portugal ist Eprex® auch unter dem Namen Epopen® durch die Firma Esteve (Laboratorios Pensa) auf dem Markt. In Polen, Russland und der Ukraine wird das Präparat unter dem Namen Epoglobin® durch Jelfa Pharmaceuticals vertrieben. Ebenfalls in Polen ist das Präparat Epox® über den Arzneimitteldistributor Genexo auf dem Markt. In Bolivien ist ein durch die Firma Laboratories Bagó produziertes Präparat mit dem Namen Eritrogen® erhältlich.
  • Hoffmann-La Roche brachte 1990 ein Epoetin-β-Präparat unter dem Namen NeoRecormon® auf den Markt. 1997 erhielt der Pharmakonzern durch die EMEA die Zulassung für die europaweite Inverkehrbringung. In Japan stellt die Firma Chugai, ein seit 2002 zu Hoffmann-La Roche gehöriges Pharmaunternehmen, ebenfalls seit 1990 ein Epoetin-β-Präparat unter dem Handelsnahmen Epogin® her.
  • Elanex Pharmaceuticals bzw. seit 2001 Baxter International entwickelte mit dem Präparat Epomax® (Epoetin ω) eine weitere EPO-Variante, die insbesondere in Ost-Europa (z.B. Polen über die in Herne ansässige Firma Fumedica) für den Vertrieb zugelassen ist. Die ω-Variante von Baxter wird in Argentinien durch die Firma Bio Sidus, in Indien durch die Firma Hindustan Antibiotics jeweils in Lizenz unter dem Handelsnahmen Hemax® produziert.

Das rekombinante Expressionsvehikel für die Produktion der Varianten Epoetin α und β ist jeweils ein genetisch modifizierter Subclon einer Ovarialzelllinie des Chinesischen Streifenhamsters (lat. Cricetulus griseus), eine sog. CHO-Zelllinie (Chinese Hamster Ovary). Bei der Produktion der Variante Epoetin ω wird eine genetisch modifizierte und subclonierte Zellinie aus der Niere eines Jungtieres des Syrischen Goldhamsters (lat. Mesocricetus auratus) verwendet (BHK-Zellen, Baby Hamster Kidney). Epoetin β weist gegenüber Epoetin α ein geringfügig höheres Molekulargewicht, einen niedrigeren Sialylierungsgrad und dennoch eine pharmakologisch nachgewiesene geringfügig längere Serumhalbwertszeit auf. Epoetin ω, bedingt durch die unterschiedliche Expressionszelllinie, unterscheidet sich von der α- und β-Variante durch ihr Glykosilierungsmuster.

Die durch zuständige Behörden gegenwärtig zugelassenen EPO-Präparate werden entweder subkutan oder intravenös appliziert. Je nach Wirkungsdauer bzw. Serumhalbwertszeit des Präparats sind mehrere Injektionen pro Woche bis hin zu einer nur einmaligen Injektion pro Monat erforderlich. Leukämie ist für EPO-Therapien kontraindikativ, aufgrund der Nebenwirkungsweise ist bei hypertonischen Patienten besondere Vorsicht geboten.

Als Therapeutikum rangiert EPO unter den 10 weltweit erfolgreichsten Medikamenten überhaupt, unter den Biopharmazeutika ist es der herausragende Blockbuster. Eprex®/Procrit ® von Johnson & Johnson erzielte im Jahr 2004 $US 3,6 Milliarden, Amgens Epogen® $US 2,6 Milliarden und Roches NeoRecormon® $US 1,7 Milliarden (Quelle: Chemical & Engineering News Nr. 83). Weltweit werden ca. 350.000 Patienten mit rekombinantem EPO behandelt.

Literatur

  • Lin F.K. (1995), Production of recombinant erythropoietin. US-Patent 5,441,868.
  • Ehrlich L. (1990), Use of EPOGEN for treatment of anemia associated with chronic renal failure. Crit Care Nurs Clin North Am 2: 101-113.
  • Bren A. et al. (2002), A comparison between epoetin omega and epoetin alfa in the correction of anemia in hemodialysis patients: a prospective, controlled crossover study. Artif Organs 26: 91-97.
  • Deicher R., Horl W.H. (2004), Differentiating factors between erythropoiesis-stimulating agents: a guide to selection for anaemia of chronic kidney disease. Drugs 64: 499-509.
  • Glaspy J., Beguin Y. (2005), Anaemia management strategies: optimising treatment using epoetin beta (NeoRecormon). Oncology 69 Suppl. 2: 8-16.
  • Littlewood T. (2005), Epoetin alfa (Eprex) and quality of life. Curr Med Res Opin. 21 Suppl 2: S1-S2.


EPO-Präparate der nächsten Generation

  • 2001 generierte Amgen unter dem Handelsnamen Aranesp® (Darbepoetin α) ein gentechnisch verändertes Erythropoetin. Dieses enthält durch den Austausch von 5 Aminosäuren weitere Zuckerseitenketten, wodurch sich der Anteil endständiger Sialinsäuren und hierdurch die Serumhalbwertszeit um ca. den Faktor 3 erhöht. Lizenznehmer für Amgens Darbepoetin α in Italien ist die Firma Dompe Biotec, die das Produkt unter dem Namen Nespo® vertreibt. Darbepoetin α wird in CHO-Zellen produziert.
  • Unter dem Aspekt einer längeren Wirkungsdauer und höheren Affinität zum EPO-Rezeptor wurde von Hoffmann-La Roche das EPO-Derivat CERA (Continuous Erythropoiesis Receptor Activator) entwickelt, bei dem das EPO-Molekül (das aus dem Präparat NeoRecormon® bekannte Epoetin β) mit einem Methoxypolyethylenglycolpolymer verknüpft ist (sog. PEGylierung). Durch die Polymerverknüpfung hat CERA ein Molekulargewicht von 66 kDa und ist damit fast doppelt so groß wie natives EPO. Die Serumhalbwertszeit nach intravenöser Applikation liegt gemäß Untersuchungen aus der klinischen Phase II bei rund 133 Stunden und ist damit mehr als 5mal länger als bei Darbepoetin α. Mit einer Zulassung des Präparats zur Markteinführung wird ab 2007 gerechnet.
  • Ein Gemeinschaftsunternehmen der Firmen Sanofi-Aventis und dem US-amerikanischen Unternehmen Transkaryotic Therapies (seit 2005 vom britischen Pharmaproduzenten Shire Pharmaceuticals [1] akquiriert) beabsichtigt die Vermarktung eines durch Genaktivierung aus transformierten, humanen Zellen erzeugten EPO unter dem Markennamen DynEpo® (Epoetin δ).
  • Die US-amerikanische Firma Affymax entwickelt ein gegenwärtig in der klinischen Phase II befindliches Präparat unter dem Namen Hematide™. Dabei handelt es sich um ein kurzkettiges, zyklisches Polypeptid mit einer Disulfidbrücke, dessen Wirkungsweise der des nativen EPO entspricht (EPO-Antagonist), dessen Aminosäuresequenz aber nicht mit der von EPO übereinstimmt.
  • Die US-amerikanische Firma Syntonix arbeitet gegenwärtig auf der Grundlage ihrer patentierten Transceptor™-Technologie an der Entwicklung eines Inhalationspräparates. Bei diesem ist das EPO-Molekül (Funktionseinheit) mit dem kristallinen Fragment (Fc) eines Antikörpers (Transporteinheit) zu einem Fusionsprotein verknüpft (sog. Epo-Fc). Da das Lungenepithel eine hohe Dichte an Rezeptoren aufweist, die mit dem Fc-Fragment interagieren (sog. FcRn), wird Epo-Fc, als Inhalationsspray appliziert, rasch in der Lunge aufgenommen und in den Blutkreislauf transportiert. Die Fc-Einheit des Fusionsproteins sorgt zudem dafür, dass die Serumhalbwertszeit gegenüber dem ’’nackten’’ EPO-Molekül deutlich verlängert ist. Dies beruht zum einen auf der erhöhten Molekülgröße (siehe CERA von Hoffmann-La Roche), die das Ausschleusen über die Niere verhindert. Zum anderen wird Epo-Fc nach Endocytose durch die Erythroblasten über den endosomalen Rezyklisierungsweg wieder in den Blutkreislauf abgegeben und steht so erneut zur Verfügung. Epo-Fc befindet sich in der klinischen Erprobungsphase (Klinik Phase I).
  • Einen gentherapeutischen Ansatz verfolgt das britische Unternehmen Oxford BioMedica mit seinem in der präklinischen Phase befindlichen Präparat Repoxygen™. Das Mittel wird intramuskulär appliziert und enthält adenovirale Genshuttle, mit Hilfe derer das EPO-Gen in die Muskelzellen transferiert wird. Die Expression des EPO-Gens wird gesteuert über einen sauerstoffsensitiven Transkriptionsfaktor. Auf diese Weise wird nur dann EPO in den transfizierten Muskelzellen gebildet, wenn die Sauerstoffsättigung im Blut einen kritischen Wert unterschreitet. Im Rahmen des Verfahrens gegen den Leichtathletiktrainer Thomas Springstein wegen des Verdachts auf Gendoping im Januar 2006 teilte Firmengründer Alan Kingsman mit, dass Oxford BioMedica die Produktion des Wirkstoffs bis auf weiteres eingestellt habe [2].

Literatur

  • Wrighton F.C. et al. (1996), Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin. Science 273: 458-464.
  • Hudson J.Q., Sameri R.M. (2002), Darbepoetin alfa, a new therapy for the management of anemia of chronic kidney disease. Pharmacotherapy 22: 141S-149S.
  • Bitonti A.J. et al. (2004), Delivery of an Erythropoietin-Fc Fusion Protein by Inhalation in Humans through an Immunoglobulin Transport Pathway. J Aerosol Med 18: 294-303.
  • Macdougall I.C. (2005), CERA (Continuous Erythropoietin Receptor Activator): a new erythropoiesis-stimulating agent for the treatment of anemia. Curr Hematol Rep 4: 436-440.


Nachahmerpräparate (Biosimilars)

Mit dem Ablauf der Patente für einige Biopharmazeutika (darunter auch EPO) seit 2004 und mit Hilfe der von der EMEA erlassenen Richtlinien für ähnliche biologisch-medizinische Produkte [3] im Allgemeinen und der Richtlinien für ähnliche biologisch-medizinische Produkte, die rekombinantes Erythropoetin enthalten [4] im Speziellen stehen die Generikahersteller in den Startlöchern. In einigen Ländern außerhalb der Europäischen Gemeinschaft sowie in Asien und Südamerika sind EPO-Generika bereits verfügbar. Innerhalb der EU ist damit frühestens Ende 2006 / Anfang 2007 zu rechnen.

  • Seit 2000 drängen zahlreiche indische Pharmaunternehmen mit eigenen Präparaten auf den heimischen Markt. In der Mehrzahl handelt es sich um EPO-Biosimilars zu Johnson & Johnsons Präparat Eprex®, das in Indien seit 1995 vertrieben wird. Hierzu zählen die Firmen Emcure mit den Präparaten Vintor® und Epofer®, Wockardt mit Wepox®, Zydus Biogen mit Zyrop®, Ranbaxy mit dem Präparat Ceriton®, LG Lifescience India mit Espogen®, Shantha Biotechnics mit Shanpoietin® sowie Intas Pharmaceuticals mit den Präparaten Epofit® und Erykine® und Claris Lifesciences mit Epotin®.
  • Das in Vancouver ansässige kanadische Pharmaunternehmen Dragon Biotech produziert seit 2004 ein generisches EPO in einer Anlage in Nanjing, China und vertreibt dieses in China, Indien, Ägypten, Brasilien, Peru, Ecuador, Trinidad & Tobago sowie in der Dominikanischen Republik und im Kosovo. Zudem kündigt das Unternehmen die Entwicklung eines neuen EPO-Produktes für den europäischen Markt an.
  • In Brasilien hat das Pharmaunternehmen Cristália in Kooperation mit dem halbstaatlichen Forschungsinstitut Instituto Butantan ein rezeptfrei erhältliches generisches EPO[5] entwickelt.
  • Im Juni 2005 erhielt das kroatische Pharmaunternehmen Pliva durch die zuständige lokale Zulassungsbehörde die Erlaubnis zur Vermarktung eines EPO-Generikums in Kroatien. Eine Ausweitung der Vertriebsrechte für den gesamteuropäischen Markt wurde in Zusammenarbeit mit dem australischen Unternehmen Mayne Pharma angestrebt, gemäß Pressemitteilung vom 22. Februar 2006[6] allerdings eingestellt. Hintergrund für diese Entscheidung sind möglicherweise die bei einer Inspektion im Januar/Februar 2006 durch die FDA festgestellten massiven Verstöße gegen die GMP-Richtlinien in Plivas Produktionsstätte in Zagreb [7]. Der isländische Generikahersteller Actavis bemüht sich dagegen offiziell seit März 2006 um eine Übernahme Plivas.
  • In England kündigte der Generikahersteller GeneMedix bereits im Mai 2005 die Markteinführung eines EPO-Präparats mit dem Produktnamen Epostim® an, der inzwischen angestrebte Termin ist allerdings erst das dritte Quartal 2007.
  • Der Unternehmensvorstand von Stada erklärte in einer Pressemitteilung vom 30. März 2006[8], dass man die Einreichung der Zulassungsunterlagen bei der EMEA für die Produktion und den Vetrieb eines EPO-Generikums im zweiten Quartal 2006 plane und mit der Markteinführung Ende 2006 bzw. Anfang 2007 zu rechnen sein werde. In vergleichbaren Entwicklungsphasen befinden sich offenbar auch Stadas Mitbewerber in Deutschland Ratiopharm[9] und Hexal.
  • Der britische Generikahersteller Therapeutic Proteins kündigte in einer Pressemitteilung vom 12. Mai 2006[10] an, Zulassungsunterlagen bei der EMEA für die Produktion und den Vetrieb eines EPO-Generikums unter dem Handelsnamen TheraPoietin® sowie für zwei weitere Biosimilars einzureichen. Die Produktion aller drei Biosimilars soll in Zusammenarbeit mit dem britischen Auftragsproduzenten Angel Biotechnology erfolgen.

Ab 1998 kam es infolge einer Novelle der EMEA zu schweren Nebenwirkungen bei der Anwendung des EPO-Mittels Eprex®/Erypo®. Auf Veranlassung der EMEA mußten sämtliche humane Proteinbestandteile im Zuge möglicher Kontaminationsrisiken durch HIV bzw. Erreger der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit aus der Formulierung von Arzneimitteln entfernt werden. Hersteller Ortho Biotech verwendete daraufhin anstelle von humanem Serumalbumin den Stabilisator Sorbitol 80 (auch als Polysorbat 80 bezeichnet). Die Zugabe von Sorbitol führte fatalerweise zur Bildung von Mizellen. Diese lösten bei mindestens 250 mit Erypo® behandelten Patienten Immunreaktionen und eine Erythroblastopenie (engl. Pure Red Cell Aplasia = PRCA) aus. Eine von Johnson & Johnson durchgeführte Studie ergab, dass Sorbitol 80 organische Bestandteile aus den unbeschichteten Gummistopfen der Applikationsspritzen herausgelöst hat, welche wiederum zur Präzipitation und Mizellbildung des Präparats geführt haben. Dieser Zwischenfall warf weltweit die Frage auf, inwieweit auch veränderte Aminosäuresequenzen, abgewandelte Glykostrukturen oder Verunreinigungen bei der Herstellung therapeutischer Proteine und deren Derivaten (z.B. Biosimilars) zu derartigen Nebenwirkungen führen können. Die brasilianische Zulassungsbehörde Agência Nacional de Vigilância Sanitária (kurz: ANVISA) verhängte noch im selben Jahr ein Importverbot zweier EPO-Präparate. Bei einer Studie der Universität Utrecht zu acht Präparaten, die außerhalb der EU und der USA vertrieben werden, wurden gravierende Mängel hinsichtlich Wirksamkeit, Reinheit und Formulierungskonsistenz festgestellt. Deshalb ist davon auszugehen, dass auf Hersteller von Biosimilars zukünftig schärfere Kontrollen im Rahmen klinischer Studien und strengere Regularien zur Markteinführung zukommen.

Literatur

  • Louët S. (2003), Lessons from Eprex for biogeneric firms. Nature Biotechnology 21 (9): 956-957.
  • Schellekens H. (2004): Biosimilar epoetins: how similar are they? EJHP Practice 3: 243-247.
  • Boven K. et al. (2005), The increased incidence of pure red cell aplasia with an Eprex formulation in uncoated rubber stopper syringes. Kidney International 67: 2346-2353.
  • Zylka-Menhorn V., Tippmann M.E. (2006), Biopharmazeutika sind „unnachahmlich“, Deutsches Ärzteblatt Jg. 103, Heft 6: A311-A314.

EPO-Doping

Je mehr rote Blutkörperchen dem menschlichen Blutkreislauf zur Verfügung stehen, desto leistungsfähiger arbeitet der gesamte Organismus, weil entsprechend viel Sauerstoff den Zellen zur Verfügung steht. Aus diesem Grund wird EPO bereits ca. seit Ende der 80er Jahre des vergangenen Jahrhunderts zum Zweck der Leistungssteigerung missbraucht. Vor allem Ausdauersportler profitieren von der Wirkung; durch den erhöhten Anteil an Erythrozyten im Blut steigt allerdings die Gefahr von Blutgerinnseln. EPO (und in der Folge auch alle weiteren Derivate wie z.B. Darbepoetin) steht seit 1990 auf der Dopingliste der internationalen Anti-Doping-Organisation WADA, der Einsatz ist also im Wettkampfsport verboten.

Prominente EPO-Dopingfälle

  • EPO wurde mit der gewichtigen Nebenrolle, die es bei der Tour de France 1998 unter anderem durch Funde bei der Festina-Mannschaft erlangte, Inbegriff der leistungssteigernden, aber nur schwer nachweisbaren Sportdroge. Die Funde und die Ermittlungen rund um die Festina-Mannschaft wurden auch unter dem Namen Festina-Affäre bekannt. In der Folge wurden die für Festina startenden Radprofis Richard Virenque, Laurent Brochard und Alex Zülle durch die UIC gesperrt.
  • Im Jahr 2000 gestand der ehemalige schweizer Radprofi Rolf Järmann, seit Beginn der 1990er Jahre systematisch mit EPO gedopt zu haben.
  • Im Vorfeld der Tour de France 2001 wurde der für das Euskaltel-Team startende Baske Txema Del Olmo des EPO-Dopings überführt. Der spanische Radsportverband sah jedoch von einer Sperre ab mit der Begründung ab, die neue Nachweismethode (siehe unten) sei fehlerhaft. Der halbstaatliche französische Anti-Dopingrat CPLD verhängte demgenüber im Februar 2002 eine dreijährige Sperre gegen Del Olmo.
  • Bei den Olympischen Winterspielen in Salt Lake City 2002 wurde der für Spanien startende Ski-Langläufer Johann Mühlegg der Einnahme von Darbepoetin überführt und der Gewinn dreier Goldmedaillen daraufhin annulliert. Bei der selben Olympiade wurden die beiden russischen Langläuferinnen Olga Danilowa und Larissa Lasutina des Dopings mit Darbepoetin überführt. Danilowa wurden ihre Goldmedaille im Verfolgungsrennen über 15 km und die Silbermedaille im Rennen über 10 km klassisch aberkannt. Lasutina mußte ihre Goldmedaille beim Rennen über 30 km sowie ihre beiden Silbermedaillen im Verfolgungsrennen über 15 km und im Rennen über 10 km zurückgeben.
  • Ebenfalls im November 2004 wurde der Teamarzt des italienischen Fussballmeisters Juventus Turin, Ricardo Agricola, vom Internationalen Sportgerichtshof (CAS) in Lausanne wegen Sportbetrugs und Verabreichung gesundheitsgefährdender Medikamente zu 22 Monaten Haft auf Bewährung verurteilt. Er hatte laut Gerichtsurteil zwischen 1994 und 1998 Spieler des Vereins unter anderem systematisch mit EPO behandelt. Agricola ist in Berufung gegangen. In besagtem Zeitraum wurde keiner der Spieler in Dopingkontrollen positiv getestet. Forderungen, Juventus die damals gewonnenen Titel abzuerkennen, hatte bereits der Präsident des Weltverbandes Fifa, Joseph Blatter, zurückgewiesen.
  • Im Dezember 2004 wurden laut einem Bericht der französischen Zeitung L'Équipe vom 23. August 2005 in tiefgefrorenen Urinkonserven des siebenmaligen Tour-de-France-Siegers Lance Armstrong sowie sechs weiterer Radprofis aus dem Jahr 1999 Spuren von nicht körpereigenem EPO nachgewiesen. Jedoch bestreitet Armstrong, gedopt zu haben.
  • Im Juni 2005 ergab eine Routinekontrolle der Fachkommission für Dopingbekämpfung FDB von Swiss Olympic ein EPO-Doping bei Brigitte McMahon, Siegerin im Triathlon bei den Olympischen Spielen von Sydney 2000. Sie trat daraufhin vom aktiven Leistungssport zurück.
  • Im August 2005 gestand der italienische Radprofi Dario Frigo vom Team Fassa Bortolo ein, bei der vergangenen Tour de France mit EPO gedopt zu haben, nachdem er vor Beginn der 11. Etappe der Tour von der französischen Polizei wegen Doping-Verdachts festgenommen worden war. Frigo wurde im Oktober 2005 in Zusammenhang mit der Dopingaffaire beim Giro d'Italia 2001 zu sechs Monaten Haft auf Bewährung und einer Geldstrafe von 12.000 Euro verurteilt.
  • Im November 2005 wurde Vuelta-Rekordsieger Roberto Heras positiv auf EPO getestet. Der Gewinn seines letzten Titels bei der Spanienrundfahrt wurde ihm daraufhin aberkannt und stattdessen der Russe Denis Menchov zum Sieger erklärt. Heras bestreitet die wissentliche Einnahme von Dopingmitteln und kündigte im Februar 2006 die Einleitung eines Berufungsverfahrens gegen die gegen ihn erlassene zweijährige Sperre an. Im besagten Zeitraum waren keine Spieler von Juventus Turin in Dopingkontrollen positiv getestet worden.

Literatur

  • Scott J., Phillips GC (2005), Erythropoietin in sports: a new look at an old problem. Curr Sports Med Rep 4: 224-226.
  • Diamanti-Kandarakis E. et al. (2005), Erythropoietin abuse and erythropoietin gene doping: detection strategies in the genomic era. Sports Medicine 35: 831-840.
  • Sharpe K. et al. (2006), A third generation approach to detect erythropoietin abuse in athletes. Haematologica 91: 356-363.

Direkte Nachweismethode

EPO kann seit 2000 auch in geringen Konzentrationen durch ein mehrstufiges Verfahren, das durch Françoise Lasne und Jaques de Ceaurriz vom Laboratoire national de détection du dopage (LNDD) entwickelt wurde, im Urin nachgewiesen werden.
Glykosilierungen von Proteinen erfolgen speziesspezifisch, d.h. das Glykosilierungsmuster von humanem EPO unterscheidet sich vom rekombinanten EPO anderer Spezies. Rekombinantes EPO wird gegenwärtig mit Hilfe transformierter Zelllinien unterschiedlicher Gattungen des Hamsters erzeugt (vgl. Abschnitt EPO als Therapeutikum). Beim rekombinanten EPO ist die Neuraminsäure zu etwa 95% an Stickstoff acetyliert, etwa 2% liegen als Glykolylacetyl-Derivat vor. Der Grad dieser unterschiedlichen Acetylierung sowie die An- und Abwesenheit sogenannter Repeats (immer wiederkehrende Zuckereinheiten) sind verantwortlich für unterschiedliche isoelektrische Punkte (pI) von humanem und rekombinantem EPO. Diese Eigenschaft wird analytisch bei der Isoelektrischen Fokussierung (IEF) zum EPO-Nachweis ausgenutzt.

Mikro- und Ultrafiltration

Im ersten Schritt werden zunächst die im Urin enthaltenen Proteine durch Mikro- und Ultrafiltration aufkonzentriert.

Isoelektrische Fokussierung

Im zweiten Schritt erfolgt die Trennung zwischen humanem und rekombinantem EPO sowie der anderen enthaltenen Proteine mittels isoelektrischer Fokussierung (IEF) in einem Polyacrylamid-Gel mit geeignetem pH-Gradienten.

Immunoblotting

Datei:Epo-Blotting.jpg
Immunoblotting- und Chemoluminiszenzverfahren zum direkten Nachweis von EPO

Im dritten Schritt erfolgt der eigentliche Nachweis durch ein Immunoblotting, bei dem die im Elektrophoresefeld aufgetrennten EPO-Isoformen auf eine Membran überführt und nachfolgend mit einem EPO-spezifischen monoklonalen Antikörper (MAK) überschichtet werden (Primäres Blotting). Die bindenden MAK werden anschließend im sauren Millieu und durch Anlegen eines elektrischen Feldes dissoziiert und auf eine zweite Membran übertragen. So erhält man ein erneutes Abbild der einzelnen EPO-Banden. Allerdings befinden sich auf der zweiten Membran keine EPO-Moleküle, sondern die spezifischen monoklonalen Antikörper (Sekundäres Blotting). Die Sichtbarmachung der Antikörperbanden erfolgt durch einen Anti-EPO-MAK spezifischen zweiten Antikörper. Dieser Sekundärantikörper ist an bestimmte Enzyme (z.B. Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase) gekoppelt, die eine Substratumsetzung katalysieren, welche sich mittels Chemiluminiszenzverfahren quantifizieren lässt (Chemoluminiszenz).

Neben diesem direkten Nachweis geben Verlaufsprotokolle anderer Blutparameter Aufschluss über möglichen EPO-Missbrauch. Zu diesen Paramtern zählt der Hämatokrit und die Konzentration anderer Blutzellen (Reticulozyten und Makrophagen), die Hämoglobin- und Eisentransferrin-Rezeptorkonzentration, sowie die Gesamtserumkonzentration von EPO. Das EPO-Derivats CERA (s.o.) läßt sich selektiv mittels eines ELISA-Tests nachweisen.
Vor völlig neuen Herausforderungen stehen Dopinglabors beim Nachweis der Variante Epoetin δ, da es sich um eine „humanisierte“ Form eines rekombinanten EPO-Moleküls handelt, die sich molekularbiologisch und biochemisch nicht vom nativen EPO-Molekül unterscheidet.

Literatur

  • Lasne F., de Ceaurriz J. (2000), Recombinant erythropoietin in urine. Nature 405: 635.
  • Lasne F. (2003), Double-blotting: a solution to the problem of nonspecific binding of secondary antibodies in immunoblotting procedures. J Immunol Methods 276: 223-226.

Quellen

  1. ↑ Akquisition Shire Pharmaceuticals vom 21.04.05
  2. ↑ „Repoxygen haben wir im Kühlfach“ FAZ vom 31. Januar 2006
  3. ↑ EMEA-Richtlinien für ähnliche biologisch-medizinische Produkte
  4. ↑ EMEA-Richtlinien für ähnliche biologisch-medizinische Produkte, die rekombinantes Erythropoetin enthalten
  5. ↑ generisches rekombinantes EPO von Cristália / Blausigel
  6. ↑ Pliva-Pressemitteilung vom 22. Februar 2006
  7. ↑ „Warning Letter“ der Food and Drug Administration an Pliva vom 28. April 2006
  8. ↑ Stada-Pressemitteilung vom 30. März 2006
  9. ↑ „Ratiopharm will in den Biosimilar-Markt vorstoßen“ vom 11. April 2006
  10. ↑ Pressemitteilung durch Therapeutic Proteins vom 12. Mai 2006
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