Rekombinase
Die Rekombination ist ein in allen Organismen vorkommender, durch spezialisierte Enzyme(Rekombinasen) katalysierter Prozess, der eine Spaltung und Neuverknüpfung von DNA-Abschnitten beinhaltet. Hierdurch wird genetische Diversität und die Reparatur geschädigter mutierter DNA ermöglicht.
Die homologe Rekombination wurde 1964 zuerst von Robin Holliday beschrieben. Sie beruht auf der Paarung ausgedehnter homologer Sequenzen, ist in Bakterien und Hefen häufig, in Säugerzellen hingegen ineffizient. Dies hängt mit der Komplexität und Größe höherer Genome zusammen und beschränkt die Einsatzmöglichkeiten des Prozesses zur gezielten genetischen Modifikation dieses Zelltyps.
Orts-spezifische Rekombination
Rekombinationsereignisse dieses Typs verlaufen über kurze Erkennungsstellen, wie sie in Hefen und Phagen vorkommen. Da es gelingt, den entsprechenden enzymatischen Apparat in Säugerzellen zu übertragen, steht ein äußerst effizientes System zur genetischen Modifikation auch höherer Zellen zur Verfügung. Davon wird seit eingen Jahren zunehmend Gebrauch gemacht.
Die am häufigsten verwendeten Rekombinationssysteme dieser Klasse leiten sich von den Rekombinasen Cre (´causes recombination´) des Phagen lambda und Flp (benannt nach der ´Flippase´-Aktivität, durch die Hefen Sequenzabschnitte invertieren), ab. Beide Enzyme gehören zur Integrase Familie der Rekombinasen, die derzeit etwa 30 Mitglieder umfasst. Die folgende Abbildung illustriert Möglichkeiten, die aus diesen Systemen resultieren. Darüber hinaus hat die systematische Mutagenese der Erkennungsstellen einen weiteren Reaktionstyp ermöglicht: den RMCE Kassettenaustauschverfahren, dem ein gesonderter Eintrag gewidmet ist.
Abbildung: Orts-spezifische Rekombinasen: Exzision und Integration am Beispiel der Rekombinasen Cre und Flp. Die Erkennungsstelle der Cre-Rekombinase (loxP-Stelle [locus of crossover]) umfasst 34 Basenpaare, darin zwei 13 Basenpaare lange Kontakstellen und ein 8 Basenpaare umfassender Abstandhalter ("Spacer"). Die Flp Erkennungsstelle (FRT [Flp-recombinase target]) ist durch eine zusätzliche Kontaktstelle etwas länger.
- Kommt es zwischen zwei gleichgerichteten Erkennungsstellen (Symbol: Halbpfeil) zu Rekombination, so wird das flankierte DNA-Segment als kreisförmiges Molekül herausgeschnitten (Exzision). Aufgrund der ursprünglichen räumlichen Nähe beider Erkennungsstellen ist dieser Prozess überaus effizient. Für die systematische Modifikation höherer Genome hat so das "flox-Verfahren" (ein DNA-Segment wird von zwei loxP-Stellen flankiert und kann daher zu einem definierbaren Zeitpunkt entfernt werden) überaus große Bedeutung erlangt.
- Die umgekehrte Reaktion (Integration eines zirkulären Vektors) ist im Prinzip auch möglich, jedoch ineffizient, da
- der Vektor die zweite Rekombinationsstelle finden muss (d.h. aufgrund der Größe des "Suchvolumens" im Zellkern)
- da er nach Rekombination ummittelbar wieder ausgeschnitten wird, sofern die Rekombinaseaktivität nicht beendet werden kann.
Als "Methode der Wahl" gilt zu diesem Zweck heute das RMCE Kassettenaustauschverfahren, welches diese Probleme umgeht.
- Die "Flippase"-Reaktion: ein durch zwei gegenläufig orientierte Rekombinasestellen flankiertes DNA-Segment wird umgedreht (Inversion; nicht gezeigt).