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Erythropoetin

ist ein Glykoprotein-Hormon
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Erythropoetin (Synonyme: EPO, Erythropoietin, Epoetin) ist ein Glykoprotein-Hormon, das als Wachstumsfaktor für die Bildung roter Blutkörperchen (Erythrozyten) während der Hämatopoese von entscheidender Rolle ist.

Herkunft und Wirkung

Im Menschen wird das EPO vorwiegend in der Niere durch die Endothelzellen der peritubulären Kapillaren und in deutlich geringeren Mengen auch durch die Hepatozyten der Leber gebildet. Zudem konnte eine Syntheseaktivität im Gehirn und Uterus nachgewiesen werden. Das EPO-Gen im Menschen befindet sich auf dem Chromosom 7 (Position 7q21-7q22). Die Synthese wird stimuliert durch eine verminderte Sauerstoffsättigung des Blutes in den Nierenarterien. Die Serumkonzentration des Hormons im gesunden Menschen liegt bei bis zu 19 mU/mL. Im Knochenmark bindet EPO an den transmembranen Erythropoetin-Rezeptor der Erythroblasten. Der Rezeptor (EpoR) gehört zur Familie der Cytokin-Rezeptoren, deren strukturelle Gemeinsamkeiten in zwei oder mehr immunglobulin-ähnlichen Domänen, vier gleichangeordneten Cystein-Resten und der extrazellulären Sequenz WSXWS bestehen. Die Bindung von EPO führt zu einer Homodimerisierung des Rezeptors, welche wiederum via Transphosphorilierung das rezeptorgekoppelte Enzym Janus Kinase 2 aktiviert. Dabei werden spezifische, intrazellulär rezeptorassoziierte Tyrosin-Reste phosporiliert und dienen hierdurch als Kopplungsstation für das Signaltransduktionsprotein STAT5, wodurch verschiedene Signaltransduktionskaskaden in Gang gesetzt werden. Dies führt zur Teilung dieser Progenitorzellen, die schließlich zu Erythrozyten ausdifferenzieren. So werden ca. 200 Milliarden Erythrozyten pro Tag gebildet. Akute und chronische Insuffizienzen infolge degenerativer Erkrankungen der Niere führen zu verminderten EPO-Bildung und damit zur renalen Anämie.

Datei:EPO.jpg
Schematische Darstellung des EPO-Moleküls

Strukturelle Eigenschaften

Das EPO-Gen (5,4 kb, 5 Exons und 4 Introns) codiert ein Pro-EPO-Protein mit 193 Aminosäureresten. Bei der posttranslationalen Modifikation wird C-terminal ein Peptid mit 27 Aminosäureresten sowie der verbleibende c-terminale Asparaginrest durch eine intrazelluläre Carboxypeptidase abgespalten. Chemisch ist humanes EPO ein saures, unverzweigtes Polypeptid aus 165 Aminosäure-Monomeren und einem Molekulargewicht von ca. 34 kDa. Der Kohlenhydratanteil, der etwa 40 % der Molekülmasse beträgt, besteht aus einer O-glykosidisch (Ser 126) und drei N-glykosidisch (Asn 24, Asn 38 und Asn 83) gebundenen Zuckerseitenketten. Die Seitenketten ihrerseits setzen sich aus den Monosacchariden Mannose, Galaktose, Fucose, N-Acteylglucosamin, N-Acetylgalactosamin und N-Acetylneuraminsäure zusammen. Letztere, auch unter dem Trivialnamen Sialinsäuren bekannt, sind entscheidend für die biologische Aktivität des Glykoproteins: Je höher der Sialylierungsgrad, desto höher ist die Aktivität und Serumhalbwertszeit des Hormons. Die Tertiärstruktur besteht aus vier antiparallelen α-Helices inklusiver benachbarter Schleifen. Natives EPO tritt in drei Varianten auf: Alpha, Beta und Asialo. Die asialylierten Isoformen, bei denen die endständigen Sialinsäuren entfernt sind, werden unmittelbar in der Leber abgereichert und sind somit wirkungslos. Funktionale Isoformen werden nach und nach durch Körperzellen, die den EPO-Rezeptor tragen, abgebaut. Dabei werden die EPO-Moleküle durch durch eine rezeptorvermittelte Endocytose in Lysosomen internalisiert und dort zerlegt.

EPO als Therapeutikum

Bereits 1836 erkannte der französische Arzt Denis Jourdanet indirekt den Zusammenhang zwischen erniedrigtem Sauerstoffpartialdruck und Erhöhung der Erythrozytenzahl, als er hämatokritische Untersuchungen an Personen durchführte, die sich längere Zeit in alpinen Höhenlagen aufgehalten hatten. Den direkten Zusammenhang stellte Friedrich Miescher 1893 her. Im Jahr 1906 wurde durch die Franzosen Paul Carnot und Catherine Deflandere erstmals die Hypothese aufgestellt, dass die Blutbildung durch einen humoralen Faktor geregelt wird. Die beiden finnischen Nephrologen Eva Bonsdorff und Eva Jalavisto gaben schließlich 1948 diesem Faktor den Namen Erythropoetin, kurz EPO.
EPO selbst wurde 1953 durch Allan Jacob Erslev entdeckt und beschrieben. Zur Schlüsselfigur der weiteren EPO-Forschung wurde jedoch Eugene Goldwasser. 1954 bestätigten er und seine Arbeitsgruppe von der University of Chicago die Arbeiten Erslevs durch eigene Ergebnisse. Goldwasser und sein Mitarbeiter Jacobson konnten 1957 indirekt nachweisen, dass EPO in der Niere gebildet wird. Die erstmalige Isolierung und Reinigung von humanem EPO aus Urin gelang besagter Arbeitsgruppe 1977. 1983 wurde die Aminosäuresequenz entschlüsselt. 1984 wurde erstmals von einer erfolgreichen Klonierung und Expression eines rekombinanten EPO (rEPO) in Escherichia coli berichtet (Quelle: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 2708 (1984)), 1985 gelang dies erstmals in Säugetierzellen (Quelle: Nature 313, 806 (1985)).

  • Das US-amerikanische Biotechnologieunternehmen Amgen brachte 1989 das erste rekombinante EPO-Präparat (Epogen®, Epoetin α) auf den Markt. In klinischen Studien der Phasen I und II konnte bereits ab 1986 an der University of Washington in Seattle nachgewiesen werden, dass die Therapie von Anämien mit rekombinantem EPO bei Krebs- und Nierenpatienten wesentlich nebenwirkungsärmer ist als Behandlungen mit Bluttransfusionen. Zu Amgen gesellten sich im Verlauf der Zeit weitere Firmen (Hoffmann-La Roche mit NeoRecormon® (Epoetin β), Johnson & Johnson mit Eprex®/Procrit® (Epoetin α), Elanex Pharmaceuticals bzw. seit 2001 Baxter International mit Epomax® (Epoetin ω)). In Europa wird Eprex®/Procrit® unter dem Handelsnamen Erypo® durch Janssen Cilag (Ortho Biotech), einer Tochtergesellschaft von Johnson & Johnson, vertrieben. Das rekombinante Expressionsvehikel für die Produktion der Varianten Epoetin α und β ist jeweils ein genetisch modifizierter Subclon einer Ovarialzelllinie des Chinesischen Streifenhamsters (lat. Cricetulus griseus), eine sog. CHO-Zelllinie (Chinese Hamster Ovary). Bei der Produktion der Variante Epoetin ω wird eine genetisch modifizierte und subclonierte Zellinie aus der Niere eines Jungtieres des Syrischen Goldhamsters (lat. Mesocricetus auratus) verwendet (BHK-Zellen, Baby Hamster Kidney). Epoetin β weist gegenüber Epoetin α ein geringfügig höheres Molekulargewicht, einen niedrigeren Sialylierungsgrad und dennoch eine pharmakologisch nachgewiesene geringfügig längere Serumhalbwertszeit auf. Epoetin ω, bedingt durch die unterschiedliche Expressionszelllinie, unterscheidet sich von der α- und β-Variante durch ihr Glykosilierungsmuster.
  • 2001 generierte Amgen unter dem Handelsnamen Aranesp® (Darbepoetin α) ein gentechnisch verändertes Erythropoetin. Dieses enthält durch den Austausch von 5 Aminosäuren weitere Zuckerseitenketten, wodurch sich der Anteil endständiger Sialinsäuren und hierdurch die Serumhalbwertszeit um ca. den Faktor 3 erhöht. Lizenznehmer für Amgens Darbepoetin α in Italien ist die Firma Dompe Biotec, die das Produkt unter dem Namen Nespo® vertreibt. Darbepoetin α wird in CHO-Zellen produziert.
  • Unter dem Aspekt einer längeren Wirkungsdauer und höheren Affinität zum EPO-Rezeptor wurde von Hoffmann-La Roche das EPO-Derivat CERA (Continuous Erythropoiesis Receptor Activator) entwickelt, bei dem das EPO-Molekül mit einem Methoxypolyethylenglycol-polymer verknüpft ist. Durch die Polymerverknüpfung hat CERA ein Molekulargewicht von 66 kDa und ist damit fast doppelt so groß wie natives EPO. Die Serumhalbwertszeit nach intravenöser Applikation liegt gemäß Untersuchungen aus der klinischen Phase II bei rund 133 Stunden und ist damit mehr als 5mal länger als bei Darbepoetin α. Mit einer Zulassung des Präparats zur Markteinführung wird ab 2007 gerechnet. CERA wird ebenfalls in CHO-Zellen exprimiert.
  • Ein Gemeinschaftsunternehmen der Firmen Sanofi-Aventis und dem US-amerikanischen Unternehmen Transkaryotic Therapies (seit 2005 vom britischen Pharmaproduzenten Shire Pharmaceuticals akquiriert [1]) beabsichtigt die Vermarktung eines durch Genaktivierung aus transformierten, humanen Zellen erzeugten EPO unter dem Markennamen DynEpo® (Epoetin δ).

Als Therapeutikum rangiert EPO unter den 10 weltweit erfolgreichsten Medikamenten überhaupt, unter den Biopharmazeutika ist es der herausragende Blockbuster. Eprex®/Procrit ® von Johnson & Johnson erzielte im Jahr 2004 $US 3,6 Milliarden, Amgens Epogen® $US 2,6 Milliarden und Roches NeoRecormon® $US 1,7 Milliarden (Quelle: Chemical & Engineering News Nr. 83). Weltweit werden ca. 350.000 Patienten mit rekombinantem EPO behandelt.

EPO-Doping

Je mehr rote Blutkörperchen dem menschlichen Blutkreislauf zur Verfügung stehen, desto leistungsfähiger arbeitet der gesamte Organismus, weil entsprechend viel Sauerstoff den Zellen zur Verfügung steht. Aus diesem Grund wird EPO bereits ca. seit Ende der 80er Jahre des vergangenen Jahrhunderts zum Zweck der Leistungssteigerung missbraucht. Vor allem Ausdauersportler profitieren von der Wirkung; durch den erhöhten Anteil an Erythrozyten im Blut steigt allerdings die Gefahr von Blutgerinnseln. EPO (und in der Folge auch alle weiteren Derivate wie z.B. Darbepoetin) steht seit 1990 auf der Dopingliste der internationalen Anti-Doping-Organisation WADA, der Einsatz ist also im Wettkampfsport verboten.

Prominente EPO-Dopingfälle

  • EPO wurde mit der gewichtigen Nebenrolle, die es bei der Tour de France 1998 unter anderem durch Funde bei der Festina-Mannschaft erlangte, Inbegriff der leistungssteigernden, aber nur schwer nachweisbaren Sportdroge. Die Funde und die Ermittlungen rund um die Festina-Mannschaft wurden auch unter dem Namen Festina-Affäre bekannt. In der Folge wurden die für Festina startenden Radprofis Richard Virenque, Laurent Brochard und Alex Zülle durch die UIC gesperrt.
  • Im Jahr 2000 gestand der ehemalige schweizer Radprofi Rolf Järmann, seit Beginn der 1990er Jahre systematisch mit EPO gedopt zu haben.
  • Im Vorfeld der Tour de France 2001 wurde der für das Euskaltel-Team startende Baske Txema Del Olmo des EPO-Dopings überführt. Der spanische Radsportverband sah jedoch von einer Sperre ab mit der Begründung ab, die neue Nachweismethode (siehe unten) sei fehlerhaft. Der halbstaatliche französische Anti-Dopingrat CPLD verhängte demgenüber im Februar 2002 eine dreijährige Sperre gegen Del Olmo.
  • Bei den Olympischen Winterspielen in Salt Lake City 2002 wurde der für Spanien startende Ski-Langläufer Johann Mühlegg der Einnahme von Darbepoetin überführt und der Gewinn dreier Goldmedaillen daraufhin annulliert. Bei der selben Olympiade wurden die beiden russischen Langläuferinnen Olga Danilowa und Larissa Lasutina des Dopings mit Darbepoetin überführt. Danilowa wurden ihre Goldmedaille im Verfolgungsrennen über 15 km und die Silbermedaille im Rennen über 10 km klassisch aberkannt. Lasutina mußte ihre Goldmedaille beim Rennen über 30 km sowie ihre beiden Silbermedaillen im Verfolgungsrennen über 15 km und im Rennen über 10 km zurückgeben.
  • Im Dezember 2004 wurden laut einem Bericht der französischen Zeitung L'Équipe vom 23. August 2005 in tiefgefrorenen Urinkonserven des siebenmaligen Tour-de-France-Siegers Lance Armstrong sowie sechs weiterer Radprofis aus dem Jahr 1999 Spuren von nicht körpereigenem EPO nachgewiesen. Jedoch bestreitet Armstrong, gedopt zu haben.
  • Im Juni 2005 ergab eine Routinekontrolle der Fachkommission für Dopingbekämpfung FDB von Swiss Olympic ein EPO-Doping bei Brigitte McMahon, Siegerin im Triathlon bei den Olympischen Spielen von Sydney 2000. Sie trat daraufhin vom aktiven Leistungssport zurück.
  • Im August 2005 gestand der italienische Radprofi Dario Frigo vom Team Fassa Bortolo ein, bei der vergangenen Tour de France mit EPO gedopt zu haben, nachdem er vor Beginn der 11. Etappe der Tour von der französischen Polizei wegen Doping-Verdachts festgenommen worden war. Frigo wurde im Oktober 2005 in Zusammenhang mit der Dopingaffaire beim Giro d'Italia 2001 zu sechs Monaten Haft auf Bewährung und einer Geldstrafe von 12.000 Euro verurteilt.
  • Im November 2005 wurde Vuelta-Rekordsieger Roberto Heras positiv auf EPO getestet. Der Gewinn seines letzten Titels bei der Spanienrundfahrt wurde ihm daraufhin aberkannt und stattdessen der Russe Denis Menchov zum Sieger erklärt. Heras bestreitet die wissentliche Einnahme von Dopingmitteln und kündigte im Februar 2006 die Einleitung eines Berufungsverfahrens gegen die gegen ihn erlassene zweijährige Sperre an.

Direkte Nachweismethode

EPO kann seit 2000 auch in geringen Konzentrationen durch ein mehrstufiges Verfahren im Urin nachgewiesen werden. Glykosilierungen von Proteinen erfolgen speziesspezifisch, d.h. das Glykosilierungsmuster von humanem EPO unterscheidet sich vom rekombinanten EPO anderer Spezies. Rekombinantes EPO wird gegenwärtig mit Hilfe transformierter Zelllinien unterschiedlicher Gattungen des Hamsters erzeugt (vgl. Abschnitt EPO als Therapeutikum). Beim rekombinanten EPO ist die Neuraminsäure zu etwa 95% an Stickstoff acetyliert, etwa 2% liegen als Glykolylacetyl-Derivat vor. Der Grad dieser unterschiedlichen Acetylierung sowie die An- und Abwesenheit sogenannter Repeats (immer wiederkehrende Zuckereinheiten) sind verantwortlich für unterschiedliche isoelektrische Punkte (pI) von humanem und rekombinantem EPO. Diese Eigenschaft wird analytisch bei der Isoelektrischen Fokussierung (IEF) zum EPO-Nachweis ausgenutzt.

Mikro- und Ultrafiltration

Im ersten Schritt werden zunächst die im Urin enthaltenen Proteine durch Mikro- und Ultrafiltration aufkonzentriert.

Isoelektrische Fokussierung

Im zweiten Schritt erfolgt die Trennung zwischen humanem und rekombinantem EPO sowie der anderen enthaltenen Proteine mittels isoelektrischer Fokussierung (IEF) in einem Polyacrylamid-Gel mit geeignetem pH-Gradienten.

Immunoblotting

Datei:Epo-Blotting.jpg
Immunoblotting- und Chemoluminiszenzverfahren zum direkten Nachweis von EPO

Im dritten Schritt erfolgt der eigentliche Nachweis durch ein Immunoblotting, bei dem die im Elektrophoresefeld aufgetrennten EPO-Isoformen auf eine Membran überführt und nachfolgend mit einem EPO-spezifischen monoklonalen Antikörper (MAK) überschichtet werden (Primäres Blotting). Die bindenden MAK werden anschließend im sauren Millieu und durch Anlegen eines elektrischen Feldes dissoziiert und auf eine zweite Membran übertragen. So erhält man ein erneutes Abbild der einzelnen EPO-Banden. Allerdings befinden sich auf der zweiten Membran keine EPO-Moleküle, sondern die spezifischen monoklonalen Antikörper (Sekundäres Blotting). Die Sichtbarmachung der Antikörperbanden erfolgt durch einen Anti-EPO-MAK spezifischen zweiten Antikörper. Dieser Sekundärantikörper ist an bestimmte Enzyme (z.B. Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase) gekoppelt, die eine Substratumsetzung katalysieren, welche sich mittels Chemiluminiszenzverfahren quantifizieren lässt (Chemoluminiszenz).

Neben diesem direkten Nachweis geben Verlaufsprotokolle anderer Blutparameter Aufschluss über möglichen EPO-Missbrauch. Zu diesen Paramtern zählt der Hämatokrit und die Konzentration anderer Blutzellen (Reticulozyten und Makrophagen, die Hämoglobin- und Eisentransferrin-Rezeptorkonzentration, sowie die Gesamtserumkonzentration von EPO. Das EPO-Derivats CERA (s.o.) läßt sich selektiv mittels eines ELISA-Tests nachweisen.
Vor völlig neuen Herausforderungen stehen Dopinglabors beim Nachweis der Variante Epoetin δ, da es sich um eine „humanisierte“ Form eines rekombinanten EPO-Moleküls handelt, die sich molekularbiologisch und biochemisch nicht vom nativen EPO-Molekül unterscheidet.

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