DNA-Sequenzierung
DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der DNA-Sequenz, also der Nukleotid-Abfolge, von genomischer DNA. Sie kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden, wobei es drei grundsätzliche Methoden zur eigentlichen Nukleotidabfolge gibt.
An die Sequenzierung schließt sich in der Regel die DNA-Sequenzanalyse an.
Sequenzierung im großen Maßstab, wie für das Humangenom-Projekt stellte die bisher größte Herausforderung für die Bioinformatik dar.
Sequenzierungsmethoden
Maxam und Gilbert Methode
Die Methode der chemischen Spaltung nach Maxam und Gilbert (1977) wurde vedrängt von der schnelleren und leichter automatisierbaren
Didesoxymethode nach Sanger
Die Didesoxmethode wird auch "kontrollierte Unterbrechung der enzymatischen Replikation" genannt und von Sanger ebenfalls 1977 vorgestellt. Im gleichen Jahr gelang damit die erste vollständige Sequenzierung eines Genoms (Bakteriophage φX174 [1]).
Man verwendet dazu heutzutage die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). In vier sonst gleiche Ansätze wird je eine unterschiedliche Base als Didesoxynukleotid (ddNTP) zugegeben. Ohne die Hydroxyfunktion ist eine DNA-Verlängerung durch DNA-Polymerase nicht möglich und es kommt zum Kettenabbruch. Da die ddNTPs zufällig eingebaut werden, bricht die DNA-Synthese an verschiedenen Stellen ab. Nach der PCR wird jeder Ansatz getrennt mittels Gelelektrophorese getrennt und man kann die Sequenz an Hand des Gels ablesen.
Sequenzierung durch Hybridisierung
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Hilfsmethoden
- Shotgun-Sequenzierung
- Chromosomal walks