Restriktionsenzyme oder Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die DNA-Moleküle aufschneiden, wobei sie die Schnittstelle an einer spezifischen Nukleotidsequenz erkennen.
Man nutzt sie zur Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle und schneidet mit ihrer Hilfe den ringförmigen DNA-Strang eines Vektors (z.B. eines Plasmids) an einer bestimmten Stelle auf. Oft trennen die Restriktionsenzyme die beiden Stränge der Vektor-DNA um einige Nukleotide versetzt, so dass so genannte "klebrige Enden" (engl. sticky ends) entstehen. Aber es gibt auch Enzyme, die die DNA glatt aufschneiden, ohne dass klebrige Enden entstehen.
DNA-Fragmente mit komplementären "klebrigen Enden" lassen sich besonders gut miteinander verknüpfen. Zerlegt man beispielsweise eine Spender-DNA mit dem gleichen Restriktionsenzym, mit dem man einen Plasmidring aufgeschnitten hat, lassen sich die entstandenen DNA-Fragmente in das Plasmid "einkleben", weil die "klebrigen Enden" zueinander passen.