Photoactivated Localization Microscopy
Photoactivated Localization Microscopy (PALM) beziehungsweise Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) sind spezielle Methoden der Lichtmikroskopie, genauer der Fluoreszenzmikroskopie. Sie beruhen auf einem lichtgesteuerten Ein- und Ausschalten von Fluoreszenz in einzelnen Molekülen. Das Ein- und Ausschalten erfolgt dabei über einen gewissen Zeitraum hinweg, über den viele einzelne Bilder aufgenommen werden. Durch eine anschließende Computerberechnung lässt sich die Position einzelner Moleküle mit einer Auflösungen jenseits der von Ernst Abbe beschriebenen optischen Auflösungsgrenze bestimmen.
Die Technik wurde 2006 von zwei Gruppen parallel entwickelt und unterschiedlich bezeichnet. Eric Betzig und Kollegen am Howard Hughes Medical Institute nannten sie PALM, Xiaowei Zhuang und Kollegen an der Harvard University nannten sie (STORM). [1][2]
Funktionsprinzip
In der klassischen Fluoreszenzmikroskopie werden an die zu untersuchenden Proteine Fluoreszenzfarbstoffe, wie z.B. GFP (Grün Fluoreszierendes Protein) gebunden, die unter dem Mikroskop beobachtet werden können. Liegen zwei einzelne Moleküle zu nah beieinander, können sie nicht mehr aufgelöst werden und erscheinen als ein einziger Punkt. Mit PALM wird dieses Problem umgangen. Als Farbstoffe werden sogenannte PA-FPs (Photoactivatable Fluorescent Proteins) genutzt, die durch Licht bestimmter Wellenlänge und Intensität gezielt aktiviert und deaktiviert werden können. Zunächst sind alle PA-FPs deaktiviert. Durch einen kurzen Lichtblitz von 405 mm Wellenlänge werden dann zufällig einige PA-FPs aktiviert und mit einer Detektionswellenlänge von 561 mm fotografiert. Dabei bleichen diese Fluoreszenzmoleküle aus. Die Moleküle erscheinen aufgrund der Beugung des Mikroskopes zunächst Verschwommen. Durch einen mathematischen Algorithmus unter Anwendung der Punktspreizfunktion wird dieser Effekt aus dem Bild herausgerechnet. Ein nächster Lichtblitz aktiviert wieder zufällig einige PA-FPs und der Vorgang wiederholt sich. Nach sehr vielen Durchgängen sind alle PA-FPs ausgebleicht und fotografiert. Ein Computerprogramm legt nun alle Teilbilder wieder übereinander und berechnet das tatsächliche Bild. Die Wahrscheinlichkeit, dass bei einem Aufnahmevorgang zwei dicht nebeneinander liegende Moleküle gleichzeitig aktiviert werden und nicht mehr von einander differenziert werden können, ist sehr klein. Hierin liegt der Grund für die sehr hohe Auflösung im Nanometerbereich.
Verbreitung und Alternativen
Mikroskope, die mit PALM arbeiten, befinden sich in der Entwicklungsphase und sind noch nicht kommerziell erhältlich. Sie stehen in Konkurrenz mit dem in Deutschland entwickelten STED-Mikroskop, bei dem es sich ebenfalls um ein Fluoreszenzmikroskop mit verbesserter lateraler Auflösung handelt. Ein großer Nachteil von PALM ist die sehr lange Akquisitionszeit (Aufnahmedauer) in der Größenordnung von Stunden bis Tagen. Ein Vorteil ist der im Vergleich zum STED Mikroskop geringere Preis. Die Aufrüstung eines klassischen Fluoreszenzmikroskopes mit PALM ist theoretisch denkbar.
Literatur
- ↑ E. Betzig et al.: Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. In: Science. Vol. 313, Nr. 5793, September 2006, S. 1642–1645, doi:10.1126/science.1127344.
- ↑ X. Zhuang et al.: Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). In: Nature Methods (published online). Band 3, September 2006, S. 793–796, doi:10.1038/nmeth929.