노던 블롯
노던 블랏(또는 RNA 블랏[1], northern blot)은 분자생물학 연구에서 샘플의 RNA(또는 분리된 전령 RNA)를 검출하여 유전자 발현을 연구하는 데 사용되는 기술이다.[2][3]
노던 브랏을 이용하면 분화 및 형태 형성뿐만 아니라 비정상적인 상태에서 특정 유전자 발현 속도를 결정함으로써 구조 및 기능에 대한 세포 제어를 관찰 할 수 있다.[4] 노던 블랏은 크기에 의해 RNA 샘플을 분리하기 위해 전기영동을 사용하고, 일부 또는 전체 표적 서열에 상보적인 혼성화 탐침을 이용한 검출을 포함한다. 노던 블랏은 실제로 전기 영동 젤로부터 블랏팅 막으로 RNA의 모세관 전달을 지칭한다.[5] 노던 블랏 기법은 1977년 James Alwine, David Kemp, George Stark에 의해 개발되었으며[6], Gerhard Heinrich의 도움을 받았다. 노던 블랏은 생물학자 Edwin Southern의 이름을 딴 최초의 블랏팅 기법인 서던 블랏과 유사하다[2]. 주요 차이점은 노던 블랏은 RNA를 분석한다는 점에서 다르다.[7]
순서
일반적인 블랏팅 절차[5]는 균질화 된 조직 샘플 또는 세포에서 총 RNA를 추출하는 것으로 시작한다. 이어서, 진핵 전령 RNA는 올리고 셀룰로스(dT) 크로마토그래피를 사용하여 단리되어 폴리 A 꼬리를 갖는 RNA만을 분리 할 수 있다.[8][9] RNA 샘플은 젤 전기 영동에 의해 분리된다. 젤은 깨지기 쉽고 탐침이 매트릭스에 들어갈 수 없기 때문에 크기로 분리된 RNA 샘플은 모세관 또는 진공 블랏팅 시스템을 통해 나일론 막으로 옮겨진다.
음전하를 띤 핵산은 친화력이 높기 때문에 양전하를 갖는 나일론 막이 노던 블랏에 사용하기에 가장 적합하다. 블랏팅에 사용되는 전이 완충액은 일반적으로 포름아마이드를 함유하는데, 이는 탐침-RNA 상호 작용의 용융 온도를 낮추어 고온에 대한 필요성을 제거하여 RNA 분해를 유발할 수 있기 때문이다.[10] RNA가 막으로 이동되면, UV광 또는 열에 의해 막에 공유 결합을 통해 고정화된다. 탐침이 표지 된 후, 막상의 RNA에 혼성화된다. 혼성화의 효율 및 특이성에 영향을 줄 수 있는 조건은 이온 강도, 점도, 이중 길이, 불일치 염기쌍 및 염기 조성을 포함한다.[11] 그 후 혼성화 신호는 엑스선 필름에 의해 검출되고, 밀도 측정에 의해 정량화된다. 노던 블랏에서 비교를 위한 대조군을 생성하기 위해, 관심있는 유전자 생성물을 나타내지 않는 샘플은 마이크로어레이 또는 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 결정 후에 사용한다.
젤
RNA 샘플은 2차 구조를 제한하기 위해 RNA의 변성제로서 폼알데하이드를 함유하는 아가로스 젤상에서 가장 분리한다.[11][12] 젤을 브로민화 에티듐(EtBr)로 염색하고 UV 광에서 관찰하여 블랏팅 전에 RNA의 품질 및 양을 관찰한다. 요소를 사용한 폴리아크릴아마이드 젤 전기 영동은 RNA 분리에도 사용될 수 있지만 단편화 된 RNA 또는 마이크로 RNA에 가장 사용한다.[13] RNA 사다리는 전기 영동 젤상에서 샘플과 함께 작동하여 수득된 단편의 크기를 관찰하지만, 총 RNA 샘플에서 리보솜 서브 유닛은 크기 마커로서 작용한다. 큰 리보솜 서브 유닛은 28S(약 5kb)이고 작은 리보솜 서브 유닛은 18S(약 2kb)이기 때문에 2개의 현저한 밴드가 젤 상에 나타난다. 이는 작은 강도(intensity)의 2배에 가깝다.[14]
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