CRISPR/Cas-Methode

2024-11-15T17:26:54Z

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[[Datei:Cas9 5AXW.png|mini|CRISPR-Cas-Komplex mit DNA]]
Die '''CRISPR-Cas-Methode''' (von englisch '''''C'''lustered '''R'''egularly '''I'''nterspaced '''S'''hort '''P'''alindromic '''R'''epeats'' – gruppierte kurze [[palindrom]]ische Wiederholungen mit regelmäßigen Abständen und '''''C'''RISPR-'''as'''sociated'' – CRISPR-assoziiertes Protein) ist eine [[Molekularbiologie|molekularbiologische]] Methode, um [[Desoxyribonukleinsäure|DNA]] gezielt zu schneiden und zu verändern ''([[Genome Editing]])''. [[Gen]]e können mit dem CRISPR-Cas-System eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden,<ref name="PMID 22745249">{{Literatur |Autor=Martin Jinek, Krzysztof Chylinski, Ines Fonfara, Michael Hauer, Jennifer A. Doudna, Emmanuelle Charpentier |Titel=A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity |Sammelwerk=Science |Band=337 |Nummer=6096 |Datum=2012-08-17 |ISSN=0036-8075 |Seiten=816–821 |DOI=10.1126/science.1225829 |PMID=22745249}}</ref> auch [[Nukleotid]]e in einem Gen können geändert werden.<ref>H. Ochiai: ''Single-Base Pair Genome Editing in Human Cells by Using Site-Specific Endonucleases.'' In: ''International journal of molecular sciences.'' Band 16, Nummer 9, 2015, S. 21128–21137, [[doi:10.3390/ijms160921128]], PMID 26404258, {{PMC|4613245}} (Review).</ref> Aufgrund der einfachen Durchführung, der [[Skalierbarkeit]] hinsichtlich unterschiedlicher Zielsequenzen und der geringen Kosten wird die CRISPR-Cas-Methode zunehmend in der Forschung eingesetzt.<ref>M. M. Mahfouz, A. Piatek, C. N. Stewart: ''Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: challenges and perspectives.'' In: ''Plant biotechnology journal.'' Band 12, Nummer 8, Oktober 2014, S. 1006–1014, [[doi:10.1111/pbi.12256]], PMID 25250853.</ref><ref>E. Pennisi: ''The CRISPR craze.'' In: ''[[Science]].'' Band 341, Nummer 6148, August 2013, S. 833–836, [[doi:10.1126/science.341.6148.833]], PMID 23970676.</ref> Gleichzeitig gibt es beim aktuellen Stand der Forschung noch Probleme bei der Spezifität durch off-target-Effekte, also Auswirkungen am Genom außerhalb der Schnittstelle.

Die wissenschaftliche Grundlage zur Entwicklung der CRISPR-Cas-Methode wurde durch die Entdeckung und Erforschung der [[CRISPR]]-Sequenzen und des damit verbundenen CRISPR-Cas-Systems im Immunsystem verschiedener [[Bakterien]] und [[Archaea]] gelegt. Die erste wissenschaftliche Dokumentation zur Entwicklung und zum Einsatz der Methode wurde 2012 durch eine Arbeitsgruppe um [[Emmanuelle Charpentier]] und [[Jennifer Doudna]] veröffentlicht. Die [[wissenschaftliche Fachzeitschrift]] ''[[Science]]'' erklärte die CRISPR-Methode zum [[Breakthrough of the Year]] 2015.<ref>{{Internetquelle |autor=Email Science |url=http://news.sciencemag.org/scientific-community/2015/12/and-science-s-breakthrough-year |titel=And Science’s Breakthrough of the Year is … |werk=news.sciencemag.org |datum=2015-12-17 |sprache=en |abruf=2015-12-17}}</ref> Für ihre Arbeiten an der CRISPR-Cas-Methode wurden die beiden Wissenschaftlerinnen mit dem [[Nobelpreis für Chemie]] 2020 ausgezeichnet.

== Prinzip ==
[[Datei:CRISPR-Cas9-Prozess Pflanzenforschung.de CC BY-SA 3.0.png|mini|Überblick der drei Phasen des CRISPR-Cas9-Prozesses als Abwehrmechanismus<ref name="Doudna&Charpentier2014">[[Jennifer Doudna]], [[Emmanuelle Charpentier]].: ''The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.'' Science 346(6213):1077 (2014), PMID 25430774, [[doi:10.1126/science.1258096]].</ref> ]]
Die CRISPR-Cas-Methode basiert auf einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus von Bakterien, dem [[CRISPR]].<ref>R. Sorek, V. Kunin, P. Hugenholtz: ''CRISPR–a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea.'' In: ''Nature reviews. Microbiology.'' Band 6, Nummer 3, März 2008, S. 181–186, {{ISSN|1740-1534}}. [[doi:10.1038/nrmicro1793]]. PMID 18157154.</ref><ref>D. Rath, L. Amlinger, A. Rath, M. Lundgren: ''The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications.'' In: ''Biochimie.'' Band 117, Oktober 2015, S. 119–128, [[doi:10.1016/j.biochi.2015.03.025]], PMID 25868999 (Review).</ref> Sie wird als Methode verwendet, um DNA an einer bestimmbaren [[DNA-Sequenz]] zu schneiden. Dadurch können beispielsweise durch zwei Schnitte DNA-Sequenzen entfernt – oder es kann im Anschluss an einen Schnitt eine andere DNA-Sequenz an der Schnittstelle eingefügt werden.

Das DNA-schneidende [[Enzym]] namens ''Cas'' (von {{enS}} ''CRISPR-associated''‚ CRISPR-assoziiert‘) bindet eine bestimmte [[RNA]]-Sequenz. Auf diese RNA-Sequenz folgt eine weitere RNA-Sequenz, die per [[Basenpaarung]] an eine DNA mit komplementärer Sequenz binden kann. Die RNA dient hierbei als Brücke zwischen ''Cas'' und der zu schneidenden DNA. Durch die Verkettung des Enzyms ''Cas'', der RNA und der DNA wird das DNA-schneidende Enzym ''Cas'' in die räumliche Nähe der gebundenen DNA gebracht, woraufhin das Enzym die (indirekt gebundene) DNA schneidet. Im Sonderfall einer Einfügung von DNA in die Schnittstelle wird eine weitere DNA hinzugegeben, die an ihren beiden Enden jeweils überlappende Sequenzen für eines der beiden Enden der Schnittstelle aufweist. Die einzufügende DNA wird durch die zelleigene [[DNA-Reparatur]] mit den Enden der Schnittstelle verbunden. Bei einer Variante des Systems ([[#dCas9-RT: Prime Editing|Prime Editing]]) ist keine einzufügende DNA für eine Einfügung nötig, da die einzufügende Sequenz durch eine RNA-Verlängerung codiert wird.

== Eigenschaften ==
[[Datei:14 Hegasy Cas9 3D Complex Wiki D CCBYSA.png|mini|3D-Struktur des CRISPR-Cas9-Komplexes]]
[[Datei:15 Hegasy Cas9 DNA Tool Wiki D CCBYSA.png|mini|CRISPR-Cas9 kann als molekulares Werkzeug gezielt DNA-Doppelstrangbrüche einführen]]
[[Datei:16 Hegasy DNA Rep Wiki D CCBYSA.png|mini|Die durch CRISPR-Cas9 gezielt eingeführten DNA-Doppelstrangbrüche eröffnen den Weg zu genetischer Manipulation]]
''Cas''-Proteine können als [[Ribonukleoprotein]]e bestimmte RNA-Sequenzen binden. Die [[Endonuklease]] ''[[Cas9]]'' (veraltet auch ''Cas5, Csn1'' oder ''Csx12'') kann eine bestimmte RNA-Sequenz (''crRNA repeat'', Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)<ref>G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys: ''Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' Band 109, Nummer 39, September 2012, S. E2579–E2586, {{ISSN|1091-6490}}. [[doi:10.1073/pnas.1208507109]]. PMID 22949671. {{PMC|3465414}}.</ref> binden und in der unmittelbaren Umgebung DNA schneiden. In Bakterien folgt auf die ''crRNA repeat''-Sequenz eine ''crRNA-spacer''-Sequenz, die an die Ziel-DNA bindet. Beide Teile werden zusammen als ''crRNA'' bezeichnet. Die ''crRNA-spacer''-Sequenz dient in der Funktion eines variablen Adapters, die komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet. Die ''crRNA-repeat''-Sequenz bildet eine RNA-[[Sekundärstruktur]] und wird dann von ''Cas9'' gebunden,<ref>V. Kunin, R. Sorek, P. Hugenholtz: ''Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats.'' In: ''Genome biology.'' Band 8, Nummer 4, 2007, S. R61, {{ISSN|1465-6914}}. [[doi:10.1186/gb-2007-8-4-r61]]. PMID 17442114. {{PMC|1896005}}.</ref> wodurch eine Änderung der [[Proteinfaltung]] von Cas9 erfolgt und die Ziel-DNA von der ''crRNA-spacer''-Sequenz durch Basenpaarung gebunden wird.<ref>F. Jiang, D. W. Taylor, J. S. Chen, J. E. Kornfeld, K. Zhou, A. J. Thompson, E. Nogales, J. A. Doudna: ''Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage.'' In: ''Science.'' Band 351, Nummer 6275, Februar 2016, S. 867–871, [[doi:10.1126/science.aad8282]], PMID 26841432.</ref> Bei der CRISPR-Cas-Methode wird die ''crRNA-spacer''-Sequenz geändert, um an eine andere Ziel-DNA zu binden. Die Sequenz des ''crRNA-spacer'' bestimmt, welche Ziel-DNA-Sequenz gebunden wird.

Neben ''Cas9'' und der ''crRNA'' ist das Vorhandensein eines PAM-[[Sequenzmotiv|Motivs]] ({{enS|protospacer adjacent motif}} [[Protospacer Adjacent Motif|‚Angrenzendes Motiv an den Protospacer‘]]) mit der Sequenz NGG (mit N als beliebige Nukleinbase gefolgt von zwei Guaninen) in der Ziel-DNA notwendig für eine Aktivierung von Cas9.<ref>S. H. Sternberg, S. Redding, M. Jinek, E. C. Greene, J. A. Doudna: ''DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.'' In: ''Nature.'' Band 507, Nummer 7490, März 2014, S. 62–67, [[doi:10.1038/nature13011]], PMID 24476820, {{PMC|4106473}}.</ref> Der Schnitt der DNA erfolgt drei Nukleotide vor dem PAM. Zudem ist noch eine weitere RNA notwendig, die [[tracrRNA]], von engl. ''trans-acting CRISPR RNA''. Die tracrRNA ist teilweise komplementär zur crRNA, weshalb sie aneinander binden. Die ''tracrRNA'' bindet an eine Vorläufer-''crRNA'', bildet eine RNA-[[Doppelhelix]] und wird durch die [[RNase III]] in die aktive Form überführt.<ref name="PMID 22745249" /><ref name="Deltcheva">E. Deltcheva, K. Chylinski, C. M. Sharma, K. Gonzales, Y. Chao, Z. A. Pirzada, M. R. Eckert, J. Vogel, E. Charpentier: ''CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.'' In: ''Nature.'' Band 471, Nummer 7340, März 2011, S. 602–607, [[doi:10.1038/nature09886]], PMID 21455174, {{PMC|3070239}}.</ref><ref name="Brouns">S. J. Brouns: ''Molecular biology. A Swiss army knife of immunity.'' In: ''Science.'' Band 337, Nummer 6096, August 2012, S. 808–809, [[doi:10.1126/science.1227253]], PMID 22904002.</ref> Die beiden RNA-Stränge der ''crRNA'' und der ''tracrRNA'' können auch in einem einzelnen, teilweise [[Hybridisierung (Molekularbiologie)|selbsthybridisierenden]] [[Ribonukleinsäure|RNA-Strang]] untergebracht werden ([[sgRNA]] ‚single guide RNA‘).<ref name="PMID 22745249" /> Durch diese Komponenten wird die DNA gebunden und von der Endonukleasefunktion nahe der Bindungsstelle an beiden Strängen der Ziel-DNA geschnitten. In lebenden Organismen folgt nach einem doppelsträngigen DNA-Schnitt eine DNA-Reparatur. Die Reparatur des erzeugten [[Doppelstrangbruch]]s erfolgt durch [[Homologie-gerichtete Reparatur|homology-directed repair]] (HDR) oder durch ''non-homologous end joining'' (NHEJ). Bei der CRISPR-Cas-Methode ist die HDR aufgrund der Genauigkeit die bevorzugte Form der DNA-Reparatur.<ref name="PMID38376092">M. Lu, S. Billerbeck: ''Improving homology-directed repair by small molecule agents for genetic engineering in unconventional yeast?-Learning from the engineering of mammalian systems.'' In: ''Microbial biotechnology.'' Band 17, Nummer 2, Februar 2024, S. e14398, {{DOI|10.1111/1751-7915.14398}}, PMID 38376092, {{PMC|1087801}}.</ref><ref name="PMID30687381">M. Liu, S. Rehman, X. Tang, K. Gu, Q. Fan, D. Chen, W. Ma: ''Methodologies for Improving HDR Efficiency.'' In: ''Frontiers in genetics.'' Band 9, 2018, S. 691, {{DOI|10.3389/fgene.2018.00691}}, PMID 30687381, {{PMC|6338032}}.</ref><ref name="PMID32899704">H. Yang, S. Ren, S. Yu, H. Pan, T. Li, S. Ge, J. Zhang, N. Xia: ''Methods Favoring Homology-Directed Repair Choice in Response to CRISPR/Cas9 Induced-Double Strand Breaks.'' In: ''[[International Journal of Molecular Sciences]].'' Band 21, Nummer 18, September 2020, S. , {{DOI|10.3390/ijms21186461}}, PMID 32899704, {{PMC|7555059}}.</ref><ref name="PMID35682671">S. A. Smirnikhina, M. I. Zaynitdinova, V. A. Sergeeva, A. V. Lavrov: ''Improving Homology-Directed Repair in Genome Editing Experiments by Influencing the Cell Cycle.'' In: ''[[International Journal of Molecular Sciences]].'' Band 23, Nummer 11, Mai 2022, S. , {{DOI|10.3390/ijms23115992}}, PMID 35682671, {{PMC|9181127}}.</ref><ref name="PMID35076280">W. Sun, H. Liu, W. Yin, J. Qiao, X. Zhao, Y. Liu: ''Strategies for Enhancing the Homology-Directed Repair Efficiency of CRISPR-Cas Systems.'' In: ''The CRISPR journal.'' Band 5, Nummer 1, Februar 2022, S. 7–18, {{DOI|10.1089/crispr.2021.0039}}, PMID 35076280.</ref>

Eine alternative Methode mit gleicher Spannbreite möglicher DNA-Zielsequenzen ist das [[CRISPR/Cpf1-System]] und das [[CRISPR/Cas12b-System|CRISPR-Cas12b-System]]. Alternativ zum CRISPR-Cas-System können teilweise [[Transcription Activator-like Effector Nuclease]]s (TALEN) und [[Zinkfingernuklease]]n (ZFN) verwendet werden. Jedoch sind diese beiden Methoden mit höherem Aufwand zur Anpassung an unterschiedliche Zielsequenzen verbunden, da zuerst ein [[Proteindesign]] zur Änderung der Bindungsspezifität notwendig ist, während die Bindungsspezifität bei Cas-Proteinen je nach Verwendung durch die gebundene ''crRNA'' bzw. ''sgRNA'' erfolgt und somit leichter zu ändern ist. Alle diese Methoden werden umgangssprachlich als ''Genschere'' bezeichnet.

=== Komponenten ===
{| class="wikitable"
|-
! Komponente
! Funktion
|-
| crRNA
| Enthält die Guide RNA, die das richtige Segment der Wirts-DNA lokalisiert, zusammen mit einer Region, die an die [[tracrRNA]] bindet (im Allgemeinen in Form einer [[Haarnadelstruktur|Haarnadelschleife]]) und einen aktiven Komplex bildet.
|-
| [[Trans-activating crRNA|tracrRNA]]
| Bindet an crRNA und bildet einen aktiven Komplex.
|-
| sgRNA
| Single-guide RNAs sind kombinierte RNAs, die aus einer tracrRNA und mindestens einer crRNA bestehen.
|-
| [[Cas9]] ([[#Alternativen zu Cas9|oder Alternative]])
| Ein Enzym, dessen aktive Form die DNA verändern kann. Es gibt viele Varianten mit unterschiedlichen Funktionen (z. B. Einzelstrangeinkerbung, Doppelstrangbruch, DNA-Bindung) aufgrund der Funktion jedes Enzyms zur Erkennung von DNA-Stellen.
|-
| Reparaturvorlage
| DNA-Molekül, das im DNA-Reparaturprozess der Wirtszelle als Vorlage dient und das Einfügen einer spezifischen DNA-Sequenz in das von Cas9 geteilte Wirtssegment ermöglicht.
|}

==== Alternativen zu Cas9 ====
{| class="wikitable"
|-
! Protein
! Hauptanwendung / Charakteristiken
! Jahr/e
|-
|[[CRISPR/Cpf1-Methode|Cas12]]
| Cas12a ist kleiner und einfacher als Cas9; Cas12b u. a. für das [[Genome Editing#Pflanzenzucht|Genome Engineering bei Pflanzen]].<ref>{{cite news |title=Researchers establish new viable CRISPR-Cas12b system for plant genome engineering |url=https://phys.org/news/2020-03-viable-crispr-cas12b-genome.html |access-date=2020-04-06 |work=phys.org |language=en-us}}</ref><ref>{{cite journal |last1=Ming |first1=Meiling |last2=Ren |first2=Qiurong |last3=Pan |first3=Changtian |last4=He |first4=Yao |last5=Zhang |first5=Yingxiao |last6=Liu |first6=Shishi |last7=Zhong |first7=Zhaohui |last8=Wang |first8=Jiaheng |last9=Malzahn |first9=Aimee A. |last10=Wu |first10=Jun |last11=Zheng |first11=Xuelian |last12=Zhang |first12=Yong |last13=Qi |first13=Yiping |title=CRISPR–Cas12b enables efficient plant genome engineering |journal=Nature Plants |date=2020-03 |volume=6 |issue=3 |pages=202–208 |doi=10.1038/s41477-020-0614-6 |pmid=32170285 }}</ref>
|
|-
|[[Cas13]]
|für [[RNA-Editing]]<ref>{{cite journal | title = RNA editing with CRISPR-Cas13 | journal = Science | volume = 358 | issue = 6366 | pages = 1019–1027 | date = 2017-11 | pmid = 29070703 | pmc = 5793859 | doi = 10.1126/science.aaq0180 | bibcode = 2017Sci...358.1019C }}</ref>
|
|-
|Cas3<ref>{{cite news |title=CRISPR-Cas3 innovation holds promise for disease cures, advancing science |url=https://news.cornell.edu/stories/2019/04/crispr-cas3-innovation-holds-promise-disease-cures-advancing-science |access-date=2021-10-24 |work=Cornell Chronicle |language=en}}</ref><ref>{{cite journal |last1=Dolan |first1=Adam E. |last2=Hou |first2=Zhonggang |last3=Xiao |first3=Yibei |last4=Gramelspacher |first4=Max J. |last5=Heo |first5=Jaewon |last6=Howden |first6=Sara E. |last7=Freddolino |first7=Peter L. |last8=Ke |first8=Ailong |last9=Zhang |first9=Yan |title=Introducing a Spectrum of Long-Range Genomic Deletions in Human Embryonic Stem Cells Using Type I CRISPR-Cas |journal=Molecular Cell |date=2019-06-06 |volume=74 |issue=5 |pages=936–950.e5 |doi=10.1016/j.molcel.2019.03.014 |language=en |issn=1097-2765}}</ref>
|
|2019
|-
|CasMINI
| Etwa doppelt so kompakt wie die gebräuchlicheren Cas9 und Cas12a.<ref>{{cite news |title=Researchers develop an engineered 'mini' CRISPR genome editing system |url=https://phys.org/news/2021-09-mini-crispr-genome.html |access-date=2021-10-18 |work=phys.org |language=en}}</ref><ref>{{cite journal |last1=Xu |first1=Xiaoshu |last2=Chemparathy |first2=Augustine |last3=Zeng |first3=Leiping |last4=Kempton |first4=Hannah R. |last5=Shang |first5=Stephen |last6=Nakamura |first6=Muneaki |last7=Qi |first7=Lei S. |title=Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing |journal=Molecular Cell |date=2021-09-03 |doi=10.1016/j.molcel.2021.08.008 |language=en |issn=1097-2765}}</ref>
| 2021
|-
|}

==== Unterschiede zwischen Cas9, Cpf1 und Cas12b ====
{| class="wikitable"
|-
! Eigenschaft !! Cas9<ref name="Ledford">Heidi Ledford: ''Alternative CRISPR system could improve genome editing.'' In: ''Nature.'' 526, 2015, S. 17, [[doi:10.1038/nature.2015.18432]].</ref> !![[Cpf1]]<ref name="Ledford" /> !! [[Cas12b]]<ref name="uniprot-072">{{UniProt|T0D7A2}}: cas12b – CRISPR-associated endonuclease Cas12b – Alicyclobacillus acidoterrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B) – cas12b gene (uniprot.org) (englisch) vom 16. Oktober 2013, abgerufen am 24. Januar 2019</ref>
|-
| '''Struktur''' || 2 RNA notwendig oder 1 sgRNA || 1 RNA notwendig (keine ''tracrRNA'') || 2 RNA notwendig oder 1 sgRNA
|-
| '''Überhang''' || keinen (blunt end) || sticky end || sticky end
|-
| '''Schnittstelle''' || proximal zur Erkennungssequenz || distal zur Erkennungssequenz || distal zur Erkennungssequenz
|-
| '''Zielsequenz''' || G-reiches [[Protospacer Adjacent Motif|PAM]] || T-reiches PAM || T-reiches PAM
|-
| '''Zelltyp''' || [[Zellteilung|teilende Zellen]] || [[ruhende Zelle]]n || unbekannt
|}

Das CRISPR-Cas-System kann durch Zugabe eines DNA-[[Oligonukleotid]]s anstatt eines RNA-Oligonukleotids auch zur Veränderung von RNA verwendet werden.<ref>M. R. O’Connell, B. L. Oakes, S. H. Sternberg, A. East-Seletsky, M. Kaplan, J. A. Doudna: ''Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.'' In: ''Nature.'' Band 516, Nummer 7530, Dezember 2014, S. 263–266, {{ISSN|1476-4687}}. [[doi:10.1038/nature13769]]. PMID 25274302.</ref><ref>C. R. Hale, P. Zhao, S. Olson, M. O. Duff, B. R. Graveley, L. Wells, R. M. Terns, M. P. Terns: ''RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex.'' In: ''Cell.'' Band 139, Nummer 5, November 2009, S. 945–956, [[doi:10.1016/j.cell.2009.07.040]], PMID 19945378, {{PMC|2951265}}.</ref> Der Effekt der Unterdrückung eines Gens durch Verwendung von CRISPR-Cas besitzt verschiedene Ähnlichkeiten mit demjenigen der [[RNA-Interferenz]], da bei beiden bakteriellen Abwehrmechanismen kurze RNA-Stücke von etwa 18 bis 20 [[Nukleotid]]en die Bindung an das Ziel vermitteln.<ref>[[Rodolphe Barrangou]], A. Birmingham, S. Wiemann, R. L. Beijersbergen, V. Hornung, A. v. Smith: ''Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 43, Nummer 7, April 2015, S. 3407–3419, [[doi:10.1093/nar/gkv226]], PMID 25800748, {{PMC|4402539}}.</ref>

=== Anpassung an die Zielsequenz ===
Wird an eine ''crRNA repeat''-Sequenz anstatt der natürlich vorkommenden ''crRNA-spacer''-Sequenz eine andere, zu einer DNA-Zielsequenz komplementäre RNA-Sequenz angefügt und diese ''crRNA'' zu einer ''tracrRNA'' hinzugegeben, schneidet ''Cas9'' die DNA nahe der geänderten Zielsequenz. Die an die Ziel-DNA bindende Sequenz besteht aus 20 Nukleotiden, von denen vor allem die 12 an das PAM angrenzenden Nukleotide für die Bindungsspezifität entscheidend sind.<ref>M. Mikami, S. Toki, M. Endo: ''Precision Targeted Mutagenesis via Cas9 Paired Nickases in Rice.'' In: ''Plant & cell physiology.'' Band 57, Nummer 5, Mai 2016, S. 1058–1068, [[doi:10.1093/pcp/pcw049]], PMID 26936792, {{PMC|4867050}}.</ref> Durch das ''Cas9'' mit den entsprechend geänderten RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige, teilweise komplementäre DNA geschnitten werden, wodurch gezielte [[Deletion]]en erzeugt werden können. Die gleichzeitige Änderung mehrerer DNA-Zielsequenzen wird als [[Multiplex Genome Editing]] bezeichnet.

=== Nukleotidsubstitution ===
Einzelne [[Cytidin]]e können durch ein [[Fusionsprotein]] aus Cas9 ohne doppelsträngige Endonuklease-Aktivität mit einer [[Cytidin-Deaminase]] in [[Thymidin]] umgewandelt werden.<ref>A. C. Komor, Y. B. Kim, M. S. Packer, J. A. Zuris, D. R. Liu: ''Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.'' In: ''Nature.'' Band 533, Nummer 7603, Mai 2016, S. 420–424, [[doi:10.1038/nature17946]], PMID 27096365, {{PMC|4873371}}.</ref> Entsprechend kann mit einem Fusionsprotein, das die [[Adenosin-Deaminase]] enthält, ein [[Adenosin]] in [[Guanosin]] verändert werden.<ref>Gaudelli, N. M. et al.: ''Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage''. In: ''[[Nature]]'', 2017, 551(7681), S. 464-471. [[doi:10.1038/nature24644]].</ref> In beiden Fällen entstehen [[Genmutation#Substitution|Substitutionsmutationen]]. Da bei diesen Methode nur einzelne [[Nukleinbasen|Basen]] verändert werden, ohne dass die DNA geschnitten wird, wird dieses Verfahren als [[Genome Editing#Base Editing|Base Editing]] bezeichnet.

=== Insertionen ===
Durch Doppelstrangbrüche kann die Häufigkeit einer [[Homologe Rekombination|homologen Rekombination]] deutlich erhöht werden,<ref>N. Rudin, E. Sugarman, J. E. Haber: ''Genetic and physical analysis of double-strand break repair and recombination in Saccharomyces cerevisiae.'' In: ''Genetics'', Band 122, Nummer 3, Juli 1989, S. 519–534, {{ISSN|0016-6731}}. PMID 2668114. {{PMC|1203726}}.</ref> wodurch ein sequenzspezifischer Schnitt durch ''Cas9'' auch zum Einfügen von DNA-Sequenzen (z. B. im Zuge der Gentherapie) verwendet werden kann, sofern die anschließend einzufügende DNA an beiden Enden jeweils eine zur jeweiligen Zielsequenz überlappende Sequenz aufweist.<ref>P. D. Hsu, E. S. Lander, F. Zhang: ''Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering.'' In: ''Cell.'' Band 157, Nummer 6, Juni 2014, S. 1262–1278, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2014.05.010]]. PMID 24906146. [http://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674%2814%2900604-7.pdf PDF] (PDF)</ref>

=== Einbringung in Zellen ===
Durch [[Transformation (Genetik)|Transformation]] oder [[Transfektion]] von einem [[Vektor (Gentechnik)|Vektor]] können Lebewesen mit dem CRISPR-Cas-System „ergänzt“ werden, die es natürlicherweise nicht besitzen, z. B. manche Bakterienstämme,<ref name="pmid23360965">W. Jiang, D. Bikard, D. Cox, F. Zhang, [[Luciano Marraffini|L. A. Marraffini]]: ''RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 31, Nummer 3, März 2013, S. 233–239, {{ISSN|1546-1696}}. [[doi:10.1038/nbt.2508]]. PMID 23360965. {{PMC|3748948}}.</ref> [[Bäckerhefe]],<ref name="pmid23460208">J. E. DiCarlo, J. E. Norville, P. Mali, X. Rios, J. Aach, G. M. Church: ''Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 41, Nummer 7, April 2013, S. 4336–4343, {{ISSN|1362-4962}}. [[doi:10.1093/nar/gkt135]]. PMID 23460208. {{PMC|3627607}}.</ref> [[Taufliege]]n,<ref name="pmid2408874">K. J. Beumer, D. Carroll: ''Targeted genome engineering techniques in Drosophila.'' In: ''Methods (San Diego, Calif.).'' Band 68, Nummer 1, Juni 2014, S. 29–37, [[doi:10.1016/j.ymeth.2013.12.002]], PMID 24412316, {{PMC|4048800}} (Review).</ref> [[Zebrabärbling]]e,<ref name="pmid23360964">W. Y. Hwang, Y. Fu, D. Reyon, M. L. Maeder, S. Q. Tsai, J. D. Sander, R. T. Peterson, J. R. Yeh, J. K. Joung: ''Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 31, Nummer 3, März 2013, S. 227–229, {{ISSN|1546-1696}}. [[doi:10.1038/nbt.2501]]. PMID 23360964. {{PMC|3686313}}.</ref> [[Mäuse]]<ref name="pmid23643243">H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila, M. M. Dawlaty, A. W. Cheng, F. Zhang, R. Jaenisch: ''One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.'' In: ''Cell.'' Band 153, Nummer 4, Mai 2013, S. 910–918, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2013.04.025]]. PMID 23643243. {{PMC|3969854}}.</ref> und [[Mensch]]en.<ref name="pmid23287722">P. Mali, L. Yang, K. M. Esvelt, J. Aach, M. Guell, J. E. DiCarlo, J. E. Norville, G. M. Church: ''RNA-guided human genome engineering via Cas9.'' In: ''Science.'' Band 339, Nummer 6121, Februar 2013, S. 823–826, {{ISSN|1095-9203}}. [[doi:10.1126/science.1232033]]. PMID 23287722. {{PMC|3712628}}.</ref><ref name="DOI10.1007/s13238-015-0153-5">Puping Liang, Yanwen Xu, Xiya Zhang, Chenhui Ding, Rui Huang, Zhen Zhang, Jie Lv, Xiaowei Xie, Yuxi Chen, Yujing Li, Ying Sun, Yaofu Bai, Zhou Songyang, Wenbin Ma, Canquan Zhou, Junjiu Huang: ''CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.'' In: ''Protein & Cell.'' 6, 2015, S. 363, [[doi:10.1007/s13238-015-0153-5]].</ref> Üblicherweise werden Gene von Cas mit [[Kernlokalisierungssignal]] und sgRNA per Plasmid in einen Organismus eingefügt, alternativ kann auch der Komplex aus Cas9 mit einer sgRNA in Zellen eingeschleust werden.<ref>L. Arora, A. Narula: ''Gene Editing and Crop Improvement Using CRISPR-Cas9 System.'' In: ''Frontiers in plant science.'' Band 8, 2017, S. 1932, [[doi:10.3389/fpls.2017.01932]], PMID 29167680, {{PMC|5682324}}.</ref>

Für ein Genome Editing in der [[Keimbahn]] werden als Methoden zur Einschleusung des CRISPR-Cas9 die [[Elektroporation]] und die [[Mikroinjektion]] eingesetzt.

=== Spezifität ===
[[Datei:Schematic of CRISPR-Cas9 off-target sites with DNA bulge and RNA bulge.jpg|hochkant=1.5|mini|Fehlbindungen durch Schleifenbildung in der Ziel-DNA (links) oder der sgRNA (rechts)]]
Bei der Erzeugung von Doppelstrangbrüchen an unerwünschten Stellen können unerwünschte [[Mutation]]en entstehen, die als ''off-target''-Effekte bezeichnet werden.<ref name="Fu_2013">Y. Fu, J. A. Foden, C. Khayter, M. L. Maeder, D. Reyon, J. K. Joung, J. D. Sander: ''High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 31, Nummer 9, September 2013, S. 822–826, [[doi:10.1038/nbt.2623]], PMID 23792628, {{PMC|3773023}}.</ref><ref>P. D. Hsu, D. A. Scott, J. A. Weinstein, F. A. Ran, S. Konermann, V. Agarwala, Y. Li, E. J. Fine, X. Wu, O. Shalem, T. J. Cradick, L. A. Marraffini, G. Bao, F. Zhang: ''DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 31, Nummer 9, September 2013, S. 827–832, [[doi:10.1038/nbt.2647]], PMID 23873081, {{PMC|3969858}}.</ref><ref name="Cho_2014">S. W. Cho, S. Kim, Y. Kim, J. Kweon, H. S. Kim, S. Bae, J. S. Kim: ''Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.'' In: ''Genome research.'' Band 24, Nummer 1, Januar 2014, S. 132–141, [[doi:10.1101/gr.162339.113]], PMID 24253446, {{PMC|3875854}}.</ref><ref name="Veres_2014">A. Veres, B. S. Gosis, Q. Ding, R. Collins, A. Ragavendran, H. Brand, S. Erdin, C. A. Cowan, M. E. Talkowski, K. Musunuru: ''Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.'' In: ''Cell stem cell.'' Band 15, Nummer 1, Juli 2014, S. 27–30, [[doi:10.1016/j.stem.2014.04.020]], PMID 24996167, {{PMC|4082799}}.</ref> Durch einen unspezifischen Schnitt können Gene in ihrer Funktion gestört werden. Unter die ''off-target''-Effekte fallen [[Punktmutation]]en (Basenänderungen),<ref>H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila, M. M. Dawlaty, A. W. Cheng, F. Zhang, R. Jaenisch: ''One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.'' In: ''[[Cell (Zeitschrift)|Cell]].'' Band 153, Nummer 4, Mai 2013, S. 910–918, [[doi:10.1016/j.cell.2013.04.025]], PMID 23643243, {{PMC|3969854}}.</ref> [[Deletion]]en (Entfernungen von DNA-Sequenzen),<ref name="Lin_2014">Y. Lin, T. J. Cradick, M. T. Brown, H. Deshmukh, P. Ranjan, N. Sarode, B. M. Wile, P. M. Vertino, F. J. Stewart, G. Bao: ''CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 42, Nummer 11, Juni 2014, S. 7473–7485, [[doi:10.1093/nar/gku402]], PMID 24838573, {{PMC|4066799}}.</ref><ref name="Cradick_2013">T. J. Cradick, E. J. Fine, C. J. Antico, G. Bao: ''CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 41, Nummer 20, November 2013, S. 9584–9592, [[doi:10.1093/nar/gkt714]], PMID 23939622, {{PMC|3814385}}.</ref> [[Insertion (Genetik)|Insertionen]] (Einfügungen von DNA-Sequenzen),<ref name="Veres_2014" /> [[Inversion (Genetik)|Inversionen]] (Einfügungen von DNA-Sequenzen mit umgekehrter Abfolge)<ref name="Veres_2014" /> und [[Translokation (Genetik)|Translokationen]] (Verbindungen mit anderen DNA-Strängen).<ref name="Cradick_2013" /><ref name="Kim_2015">D. Kim, S. Bae, J. Park, E. Kim, S. Kim, H. R. Yu, J. Hwang, J. I. Kim, J. S. Kim: ''Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.'' In: ''Nature methods.'' Band 12, Nummer 3, März 2015, S. 237–43, 1 p following 243, [[doi:10.1038/nmeth.3284]], PMID 25664545.</ref> Es wurde beschrieben, dass teilweise über 50 % der Schnitte ''off-target'' erfolgten.<ref name="Fu_2013" /><ref name="Lin_2014" /> Die Bindung der sgRNA an eine Zielsequenz toleriert auch Basenfehlpaarungen, wodurch sich die Zahl der möglichen Bindungsstellen auf mehrere tausend erhöht, wodurch experimentelle und sicherheitstechnische Probleme entstehen,<ref name="Fu_2013" /><ref>P. D. Hsu, E. S. Lander, F. Zhang: ''Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.'' In: ''[[Cell (Zeitschrift)|Cell]].'' Band 157, Nummer 6, Juni 2014, S. 1262–1278, [[doi:10.1016/j.cell.2014.05.010]], PMID 24906146, {{PMC|4343198}}.</ref> die typisch für unspezifische Mutationen sind. Experimentelle Probleme sind irreführende und nicht [[Reproduzierbarkeit|reproduzierbare]] Ergebnisse.<ref name="Cong_2015">L. Cong, F. Zhang: ''Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.'' In: ''Methods in molecular biology.'' Band 1239, 2015, S. 197–217, {{DOI|10.1007/978-1-4939-1862-1_10}}, PMID 25408407.</ref> Als sicherheitstechnisches Problem wird eine mögliche Entstehung von [[Krebs (Medizin)|Krebs]] angesehen.<ref>A. Eid, M. M. Mahfouz: ''Genome editing: the road of CRISPR/Cas9 from bench to clinic.'' In: ''Experimental & molecular medicine.'' Band 48, Nummer 10, 10 2016, S. e265, [[doi:10.1038/emm.2016.111]], PMID 27741224, {{PMC|5099421}}.</ref> Die Ursachen für unspezifische Schnitte lassen sich in Basenfehlpaarungen und Schleifenbildungen (der sgRNA oder der Ziel-DNA) einteilen.<ref name="Lin_2014" />

Im Jahr 2015 hat ein Team chinesischer Forscher 86 menschlichen Embryonen die korrekte Version des Beta-Globin-Gens injiziert, um den der Beta-Thalassämie zugrunde liegenden Defekt zu korrigieren; dabei wurde festgestellt, dass das korrekte Gen an der richtigen Stelle nur in vier Fällen nachgewiesen werden konnte, in den vier Stellen lag aber ein [[Mosaik (Genetik)|Mosaik]] vor.<ref name="Hardt">{{Literatur |Autor=Annika Hardt |Titel=Technikfolgenabschätzung des CRISPR/Cas-Systems, Über die Anwendung in der menschlichen Keimbahn |Verlag=De Gruyter |Ort=Berlin, Boston |Datum=2019 |ISBN=978-3-11-062170-9 |Online=https://www.degruyter.com/view/product/510634 |Abruf=2019-10-09}}</ref>

=== Erhöhung der Spezifität ===
Zur Minimierung unspezifischer DNA-Schnitte und der daraus potentiell folgenden [[Mutagenese]] werden verschiedene Ansätze zur Erhöhung der [[Beurteilung eines Klassifikators|Spezifität]] untersucht,<ref name="Fu_2014b">Y. Fu, J. D. Sander, D. Reyon, V. M. Cascio, J. K. Joung: ''Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.'' In: ''[[Nature Biotechnology]]'', Band 32, Nummer 3, März 2014, S. 279–284, [[doi:10.1038/nbt.2808]], PMID 24463574, {{PMC|3988262}}.</ref><ref>K. Standage-Beier, Q. Zhang, X. Wang: ''Targeted Large-Scale Deletion of Bacterial Genomes Using CRISPR-Nickases.'' In: ''ACS synthetic biology.'' Band 4, Nummer 11, November 2015, S. 1217–1225, [[doi:10.1021/acssynbio.5b00132]], PMID 26451892, {{PMC|4655420}}.</ref> wie Proteindesign der Cas9 oder Ersatz der Endonukleaseaktivität von Cas9 durch [[Fusionsprotein|Kombination]] mit anderen Endonukleasen.<ref name="Tsai_2014b">S. Q. Tsai, N. Wyvekens, C. Khayter, J. A. Foden, V. Thapar, D. Reyon, M. J. Goodwin, M. J. Aryee, J. K. Joung: ''Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 32, Nummer 6, Juni 2014, S. 569–576, [[doi:10.1038/nbt.2908]], PMID 24770325, {{PMC|4090141}}.</ref> Entsprechend wurden verschiedene Methoden zur Detektion solcher Mutationen entwickelt.<ref name="Kim_2015" /><ref>V. Pattanayak, J. P. Guilinger, D. R. Liu: ''Determining the specificities of TALENs, Cas9, and other genome-editing enzymes.'' In: ''Methods in enzymology.'' Band 546, 2014, S. 47–78, [[doi:10.1016/B978-0-12-801185-0.00003-9]], PMID 25398335, {{PMC|4440668}}.</ref><ref>J. Zischewski, R. Fischer, L. Bortesi: ''Detection of on-target and off-target mutations generated by CRISPR/Cas9 and other sequence-specific nucleases.'' In: ''[[Biotechnology Advances]].'' Band 35, Nummer 1, 2017 Jan – Feb, S. 95–104, [[doi:10.1016/j.biotechadv.2016.12.003]], PMID 28011075.</ref><ref name="Tsai_2017">S. Q. Tsai, N. T. Nguyen, J. Malagon-Lopez, V. V. Topkar, M. J. Aryee, J. K. Joung: ''CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.'' In: ''Nature methods.'' Band 14, Nummer 6, Juni 2017, S. 607–614, [[doi:10.1038/nmeth.4278]], PMID 28459458, {{PMC|5924695}}.</ref><ref>P. Cameron, C. K. Fuller, P. D. Donohoue, B. N. Jones, M. S. Thompson, M. M. Carter, S. Gradia, B. Vidal, E. Garner, E. M. Slorach, E. Lau, L. M. Banh, A. M. Lied, L. S. Edwards, A. H. Settle, D. Capurso, V. Llaca, S. Deschamps, M. Cigan, J. K. Young, A. P. May: ''Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage.'' In: ''Nature methods.'' Band 14, Nummer 6, Juni 2017, S. 600–606, [[doi:10.1038/nmeth.4284]], PMID 28459459.</ref> Ebenso wurden Computerprogramme und Datenbanken entwickelt, um ''off-target''-Effekte vorherzusagen.<ref>R. Singh, C. Kuscu, A. Quinlan, Y. Qi, M. Adli: ''Cas9-chromatin binding information enables more accurate CRISPR off-target prediction.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 43, Nummer 18, Oktober 2015, S. e118, [[doi:10.1093/nar/gkv575]], PMID 26032770, {{PMC|4605288}}.</ref><ref>S. Q. Tsai, Z. Zheng, N. T. Nguyen, M. Liebers, V. V. Topkar, V. Thapar, N. Wyvekens, C. Khayter, A. J. Iafrate, L. P. Le, M. J. Aryee, J. K. Joung: ''GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 33, Nummer 2, Februar 2015, S. 187–197, [[doi:10.1038/nbt.3117]], PMID 25513782, {{PMC|4320685}}.</ref>

==== Paired Nickases ====
Die Mutation von [[Asparaginsäure]] zu [[Alanin]] an der Position 10 in Cas9 (kurz: D10A) oder von [[Histidin]] zu Alanin an der Position 840 (H840A) inaktiviert die doppelsträngige Endonukleasefunktion des gebundenen DNA-Stranges unter Erhalt der RNA-DNA-Bindungsfunktion und einer einzelsträngigen Endonukleasefunktion.<ref name="Ran">F. A. Ran, P. D. Hsu, C. Y. Lin, J. S. Gootenberg, S. Konermann, A. E. Trevino, D. A. Scott, A. Inoue, S. Matoba, Y. Zhang, F. Zhang: ''Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.'' In: ''Cell.'' Band 154, Nummer 6, September 2013, S. 1380–1389, [[doi:10.1016/j.cell.2013.08.021]], PMID 23992846, {{PMC|3856256}}.</ref><ref>K. Ishida, P. Gee, A. Hotta: ''Minimizing off-Target Mutagenesis Risks Caused by Programmable Nucleases.'' In: ''International journal of molecular sciences.'' Band 16, Nummer 10, 2015, S. 24751–24771, [[doi:10.3390/ijms161024751]], PMID 26501275, {{PMC|4632775}} (Review).</ref> Zudem wird die Spezifität durch die [[Affinität (Biochemie)|Affinität]] der RNA-DNA-Bindung an Cas9 bestimmt.<ref>H. O’Geen, A. S. Yu, D. J. Segal: ''How specific is CRISPR/Cas9 really?'' In: ''Current opinion in chemical biology.'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] Oktober 2015, [[doi:10.1016/j.cbpa.2015.10.001]], PMID 26517564.</ref><ref>T. Koo, J. Lee, J. S. Kim: ''Measuring and Reducing Off-Target Activities of Programmable Nucleases Including CRISPR-Cas9.'' In: ''Molecules and cells.'' Band 38, Nummer 6, Juni 2015, S. 475–481, [[doi:10.14348/molcells.2015.0103]], PMID 25985872, {{PMC|4469905}} (Review).</ref><ref>Y. Ma, L. Zhang, X. Huang: ''Genome modification by CRISPR/Cas9.'' In: ''The FEBS journal.'' Band 281, Nummer 23, Dezember 2014, S. 5186–5193, [[doi:10.1111/febs.1311]], PMID 25315507 (Review).</ref> Durch Verwendung zweier verschiedener sgRNA, deren an die Ziel-DNA bindende Sequenzen geringfügig versetzt sind, entstehen zwei verschieden bindende Cas-RNA-Komplexe, wodurch die Spezifität des Schnitts erhöht werden kann.<ref name="Ran" /><ref>P. Mali, J. Aach, P. B. Stranges, K. M. Esvelt, M. Moosburner, S. Kosuri, L. Yang, G. M. Church: ''CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 31, Nummer 9, September 2013, S. 833–838, [[doi:10.1038/nbt.2675]], PMID 23907171, {{PMC|3818127}}.</ref> Dabei werden zwei geringfügig verschiedene Cas9-sgRNA-Komplexe mit unterschiedlicher Spezifität gebildet (''paired nickases''). Zudem entstehen durch die versetzten [[Einzelstrangbruch|Einzelstrangbrüche]] [[sticky end]]s, die eine Insertion einer DNA mit komplementären sticky ends erleichtern. Einzelstrangbrüche werden durch die [[Basenexzisionsreparatur]]<ref name="Ran" /> und die HDR geschlossen,<ref>J. Lee, J. H. Chung, H. M. Kim, D. W. Kim, H. Kim: ''Designed nucleases for targeted genome editing.'' In: ''Plant biotechnology journal.'' Band 14, Nummer 2, Februar 2016, S. 448–462, [[doi:10.1111/pbi.12465]], PMID 26369767.</ref> die weniger Mutationen als die Reparatur per NHEJ erzeugen.<ref name="Ran" />

==== Proteindesign von Cas9 ====
Die Mutation D1135E (Änderung von Asparaginsäure zu [[Glutaminsäure]] an der Position 1135) von SpCas9 verändert die Bindungsspezifität für das ''protospacer adjacent motif'' (PAM) und senkt die Anzahl unspezifischer Schnitte.<ref>B. P. Kleinstiver, M. S. Prew, S. Q. Tsai, V. V. Topkar, N. T. Nguyen, Z. Zheng, A. P. Gonzales, Z. Li, R. T. Peterson, J. R. Yeh, M. J. Aryee, J. K. Joung: ''Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.'' In: ''[[Nature]].'' Band 523, Nummer 7561, Juli 2015, S. 481–485, [[doi:10.1038/nature14592]], PMID 26098369, {{PMC|4540238}}.</ref> Auch die ''HF1''-Mutante von Cas9 führt zu einer Minderung unspezifischer DNA-Schnitte.<ref>B. P. Kleinstiver, V. Pattanayak, M. S. Prew, S. Q. Tsai, N. T. Nguyen, Z. Zheng, J. K. Joung: ''High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.'' In: ''[[Nature]].'' Band 529, Nummer 7587, Januar 2016, S. 490–495, [[doi:10.1038/nature16526]], PMID 26735016, {{PMC|4851738}}.</ref>

==== dCas9-FokI ====
Die Kombination von Cas9 mit inaktivierter Nukleasefunktion (dCas9) mit der Endonuklease [[FokI]] wurde entwickelt, um die Spezifität des DNA-Schnitts zu erhöhen.<ref name="Tsai_2014b" /><ref>Guilinger, J. P., Thompson, D. B. & Liu, D. R. (2014). Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nature Biotechnol. 32, 577–582 [[doi:10.1038/nbt.2909]]</ref><ref>N. Wyvekens, V. V. Topkar, C. Khayter, J. K. Joung, S. Q. Tsai: ''Dimeric CRISPR RNA-Guided FokI-dCas9 Nucleases Directed by Truncated gRNAs for Highly Specific Genome Editing.'' In: ''Human gene therapy.'' Band 26, Nummer 7, Juli 2015, S. 425–431, [[doi:10.1089/hum.2015.084]], PMID 26068112, {{PMC|4509490}}.</ref> FokI wird nur als [[Homodimer]] aktiv. Dadurch wird die Anzahl unspezifischer Schnitte auf 1/10.000 gemindert.

==== BhCas12b v4 ====
Das Protein [[Cas12b]] (alter Name ''C2c1'', ein Cas des Typs V, Klasse II) aus ''[[Bacillus hisashii]]'', abgekürzt BhCas12b, ist mit 1108 Aminosäuren kleiner als SpCas9 (1368 Aminosäuren) und hat daher auch ein kleineres Gen, was die Verwendung in [[Viraler Vektor|viralen Vektoren]] (insbesondere [[Adeno-assoziiertes Virus|AAV-Vektoren]]) erleichtert.<ref name="Strecker">Jonathan Strecker, Sara Jones, Balwina Koopal, [[Jonathan Schmid-Burgk]], Bernd Zetsche, Linyi Gao, Kira S. Makarova, Eugene V. Koonin & Feng Zhang: ''Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing.'' In: ''[[Nature Communications]].'' Band 10, Nummer 1, Januar 2019, S. 212, [[doi:10.1038/s41467-018-08224-4]], PMID 30670702.</ref> Allerdings erzeugt der [[Wildtyp]] von BhCas12b bei 37 °C nur [[Einzelstrangbruch|Einzelstrangbrüche]].<ref name="Strecker" /> Daher wurde eine Mutante von BhCas12b namens BhCas12b v4 entwickelt ([[Lysin|K]]846[[Arginin|R]]/[[Serin|S]]893R/[[Glutaminsäure|E]]837[[Glycin|G]]), die auch bei der Körpertemperatur von Säugetieren Doppelstrangbrüche und weniger unspezifische Schnitte erzeugt.<ref name="Strecker" />

==== dCas9-RT: Prime Editing ====
Eine deaktivierte Cas9 (dCas9) – die noch über eine RNA an DNA binden kann, aber ohne DNA zu schneiden – wurde als Fusionsprotein mit einer [[Reverse Transkriptase|reversen Transkriptase]] (RT) kombiniert.<ref name="DOI10.1038/s41586-019-1711-4">Andrew V. Anzalone, Peyton B. Randolph, Jessie R. Davis, Alexander A. Sousa, Luke W. Koblan, Jonathan M. Levy, Peter J. Chen, Christopher Wilson, Gregory A. Newby, Aditya Raguram, David R. Liu: ''Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.'' In: ''Nature.'', [[doi:10.1038/s41586-019-1711-4]].</ref> Reverse Transkriptasen verwenden eine RNA-Vorlage, um DNA herzustellen – sie sind RNA-abhängige [[DNA-Polymerase]]n. Zusätzlich wird eine ''prime editing guide RNA'' (pegRNA) benötigt, die sowohl die '' crRNA-repeat''-Sequenz für die Bindung von Cas9 und eine an die Ziel-DNA bindende RNA-Sequenz als auch eine RNA-Vorlagensequenz zur Änderung der DNA-Sequenz (analog zu einem [[Primer]]) enthält.<ref name="DOI10.1038/s41586-019-1711-4" /> Dadurch können Insertionen, Deletionen und alle 12 möglichen Punktmutationen durchgeführt werden, ohne dass mutationsanfällige Doppelstrangbrüche entstehen und im Falle einer Insertion ohne Notwendigkeit einer einzufügenden DNA-Sequenz.<ref name="DOI10.1038/s41586-019-1711-4" />

== Regulation ==
Die Verwendung von [[Anti-CRISPR-Proteine]]n wurde zur konditionalen Hemmung von CRISPR-Cas sowie zur zeitlichen, örtlichen ([[zelltyp]]spezifischen) oder [[zellzyklus]]abschnittsspezifischen Steuerung der CRISPR-Cas-Methode vorgeschlagen.<ref name="Maxwell">K. L. Maxwell: ''The Anti-CRISPR Story: A Battle for Survival.'' In: ''Molecular cell.'' Band 68, Nummer 1, Oktober 2017, S. 8–14, [[doi:10.1016/j.molcel.2017.09.002]], PMID 28985512.</ref> Da CRISPR-Cas DNA schneidet, solange es aktiv ist, kann eine zeitliche Begrenzung auch unspezifische Schnitte begrenzen, die zu unerwünschten Mutationen führen können.<ref name="Maxwell" />

Beispielsweise werden Anti-CRISPR-Proteine zu einem gewünschten Zeitpunkt [[Induktion (Genetik)|induziert]]<ref>A. Pawluk, N. Amrani, Y. Zhang, B. Garcia, Y. Hidalgo-Reyes, J. Lee, A. Edraki, M. Shah, E. J. Sontheimer, K. L. Maxwell, A. R. Davidson: ''Naturally Occurring Off-Switches for CRISPR-Cas9.'' In: ''[[Cell (Zeitschrift)|Cell]].'' Band 167, Nummer 7, Dezember 2016, S. 1829–1838.e9, [[doi:10.1016/j.cell.2016.11.017]], PMID 27984730, {{PMC|5757841}}.</ref> oder es werden [[Fusionsprotein]]e von Anti-CRISPR-Proteinen mit [[Optogenetik|lichtgesteuerten]] Proteinen zur zeitlichen Steuerung der Methode verwendet.<ref name="Bubeck">F. Bubeck, M. D. Hoffmann, Z. Harteveld, S. Aschenbrenner, A. Bietz, M. C. Waldhauer, K. Börner, J. Fakhiri, C. Schmelas, L. Dietz, D. Grimm, B. E. Correia, R. Eils, D. Niopek: ''Engineered anti-CRISPR proteins for optogenetic control of CRISPR-Cas9.'' In: ''Nature methods.'' Band 15, Nummer 11, November 2018, S. 924–927, [[doi:10.1038/s41592-018-0178-9]], PMID 30377362.</ref> Die Kombination lichtsensitiver Proteine mit Anti-CRISPR-Proteinen ermöglicht eine Aktivierung von CRISPR-Cas nur während einer Bestrahlung mit Licht, beispielsweise die Kombination des Anti-CRISPR-Proteins ''AcrIIA4'' (ein Hemmstoff von [[Cas9]]) mit dem lichtsensitiven Protein ''LOV2'' aus ''[[Avena sativa]]'' (Saathafer), die auch ''CASANOVA'' genannt wird.<ref name="Bubeck" /> Durch die Verwendung zelltypspezifischer [[Promotor (Genetik)|Promotoren]] vor den Genen von Cas und sgRNA kann die örtliche Wirkung gesteuert werden. Außerdem wurde durch die Kombination der Gene von Anti-CRISPR-Proteinen (''AcrIIC1'', ''AcrIIC3'' und ''AcrIIC1'') mit Bindungsstellen für [[MicroRNA|miRNAs]], die nur in bestimmten Geweben ([[Hepatozyt|Leberzellen]] und [[Herzmuskel]]zellen) vorkommen und dort die Bildung des Anti-CRISPR-Proteins hemmen, eine gewebespezifische Steuerung für Leber- und Herzmuskelzellen ermöglicht.<ref>M. D. Hoffmann, S. Aschenbrenner, S. Grosse, K. Rapti, C. Domenger, J. Fakhiri, M. Mastel, K. Börner, R. Eils, D. Grimm, D. Niopek: ''Cell-specific CRISPR-Cas9 activation by microRNA-dependent expression of anti-CRISPR proteins.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 47, Nummer 13, Juli 2019, S. e75, [[doi:10.1093/nar/gkz271]], PMID 30982889, {{PMC|6648350}}.</ref> Durch die Verwendung zellzyklusabschnittsspezifischer Promotoren (Promotoren von [[Cycline]]n) kann eine Wirkung auf einen Abschnitt im Zellzyklus begrenzt werden.

== Typen ==
Es existieren mehr als 40 verschiedene ''Cas''-Proteinfamilien.<ref name="Haft">D. H. Haft, J. Selengut, E. F. Mongodin, K. E. Nelson: ''A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes.'' In: ''PLoS computational biology.'' Band 1, Nummer 6, November 2005, S. e60, {{ISSN|1553-7358}}. [[doi:10.1371/journal.pcbi.0010060]]. PMID 16292354. {{PMC|1282333}}.</ref> Die Familien können in zwei Klassen mit sechs Typen (Klasse I mit Typen I, III und IV sowie Klasse II mit Typen II, V und VI) und weiter in mehr als 30 Subtypen<ref name="DOI10.1089/crispr.2018.0033">Kira S. Makarova, Yuri I. Wolf, Eugene V. Koonin: ''Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?.'' In: ''The CRISPR Journal.'' Band 1, 2018, S. 325, [[doi:10.1089/crispr.2018.0033]].</ref> eingeteilt werden.<ref name="Nishimasu">H. Nishimasu, O. Nureki: ''Structures and mechanisms of CRISPR RNA-guided effector nucleases.'' In: ''Current opinion in structural biology.'' Band 43, April 2017, S. 68–78, [[doi:10.1016/j.sbi.2016.11.013]], PMID 27912110.</ref><ref name="DOI10.1126/science.aaa4535">D. W. Taylor, Y. Zhu, R. H. J. Staals, J. E. Kornfeld, A. Shinkai, J. van der Oost, E. Nogales, J. A. Doudna: ''Structures of the CRISPR-Cmr complex reveal mode of RNA target positioning.'' In: ''Science.'' 348, 2015, S. 581, [[doi:10.1126/science.aaa4535]].</ref> Bei Klasse I besteht der Proteinanteil aus mehreren Proteinen in einem [[Proteinkomplex]] (Effektorkomplex), während Klasse II nur ein Protein (Effektorprotein) verwendet.<ref name="Nishimasu" /> Typ I und II binden und schneiden doppelsträngige DNA und III-A dsDNA sowie RNA,<ref name="DOI10.1016/j.jmb.2014.09.029">Tomoyuki Numata, Hideko Inanaga, Chikara Sato, Takuo Osawa: ''Crystal Structure of the Csm3–Csm4 Subcomplex in the Type III-A CRISPR–Cas Interference Complex.'' In: ''Journal of Molecular Biology.'' Band 427, 2015, S. 259, [[doi:10.1016/j.jmb.2014.09.029]].</ref> während Typ III-B einzelsträngige RNA oder DNA<ref name="DOI10.1093/nar/gkw1274">Wenyuan Han, Yingjun Li, Ling Deng, Mingxia Feng, Wenfang Peng, Søren Hallstrøm, Jing Zhang, Nan Peng, Yun Xiang Liang, Malcolm F. White, Qunxin She: ''A type III-B CRISPR-Cas effector complex mediating massive target DNA destruction.'' Band 45, Nummer 4, In: ''Nucleic Acids Research.'', S. 1983–1993, [[doi:10.1093/nar/gkw1274]].</ref> bindet und schneidet.<ref name="DOI10.1126/science.aaa4535" /><ref name="PMID 24909109">J. van der Oost, E. R. Westra, R. N. Jackson, B. Wiedenheft: ''Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems.'' In: ''Nature reviews. Microbiology.'' Band 12, Nummer 7, Juli 2014, S. 479–492, [[doi:10.1038/nrmicro3279]], PMID 24909109, {{PMC|4225775}}.</ref> Bei allen Typen erfolgt die Bildung des ''spacers'' in Bakterien durch ''Cas1'' und ''Cas2''.<ref name="PMID 24909109" /> Bei den Typen I-A und I-E erfolgt der DNA-Schnitt durch ''Cas3'', während bei Typ II ''Cas9'', bei Typ III-A ''Csm6'' und bei Typ III-B ''Cmr4'' den Schnitt bewirkt.<ref name="PMID 24909109" /> Die Typen I und III sind strukturell verwandt, was einen gemeinsamen Ursprung nahelegt.<ref name="DOI10.1126/science.aaa4535" /> Das [[α-Helix|helikale]] Protein ''Cas'' des Typs III besitzt mehrere ''[[β-Schleife|β-hairpins]]'', die in Abständen von sechs Nukleotiden die Doppelhelix der crRNA und der Ziel-RNA für den Schnitt auseinanderdrücken.<ref name="DOI10.1126/science.aaa4535" />

Das Cas9 stammt meistens entweder aus ''[[Streptococcus pyogenes]]'' (''SpCas9'') oder ''[[Staphylococcus aureus]]'' (''SaCas9''), wobei die kodierende DNA-Sequenz von SaCas9 etwa 1000 Basenpaare kürzer ist.<ref name="DOI10.1038/nature14299">F. Ann Ran, L. e. Cong, Winston X. Yan, David A. Scott, Jonathan S. Gootenberg, Andrea J. Kriz, Bernd Zetsche, Ophir Shalem, Xuebing Wu, Kira S. Makarova, Eugene V. Koonin, Phillip A. Sharp, Feng Zhang: ''In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.'' In: ''Nature.'' 520, 2015, S. 186, [[doi:10.1038/nature14299]].</ref> Cas9 gehört zum Typ II und wird vermehrt eingesetzt, da der Proteinanteil nur aus einem Protein besteht, wodurch die [[Klonierung]] und [[Überexpression]] weniger aufwändig ist. Cas-Proteine des Typs I sind dagegen [[Proteinkomplex]]e aus mehreren kleinen Proteinen.<ref>A. Plagens, H. Richter, E. Charpentier, L. Randau: [http://femsre.oxfordjournals.org/content/39/3/442.full.pdf ''DNA and RNA interference mechanisms by CRISPR-Cas surveillance complexes.'' In: ''FEMS microbiology reviews.''] (PDF; 2,7 MB) Band 39, Nummer 3, Mai 2015, S. 442–463, [[doi:10.1093/femsre/fuv019]], PMID 25934119.</ref>

=== Klassifizierung ===
Aufgrund der evolutionären Entwicklung von [[Krankheitserreger|Pathogenen]] und der daraus resultierenden Vielfalt an Erregern müssen sich antivirale Abwehrmechanismen den verschiedenen Pathogenen anpassen können. Dieses Phänomen beschreibt man in der englischsprachigen Literatur als ''evolutionary arms race'' (deutsch ''evolutionäres Wettrüsten'').<ref name="DOI10.1002/bies.201000071">Adi Stern, Rotem Sorek: ''The phage-host arms race: Shaping the evolution of microbes.'' In: ''BioEssays.'' Band 33, 2011, S. 43, [[doi:10.1002/bies.201000071]].</ref><ref name="DOI10.1146/annurev-micro-090816-093830">Eugene V. Koonin, Kira S. Makarova, Yuri I. Wolf: ''Evolutionary Genomics of Defense Systems in Archaea and Bacteria.'' In: ''Annual Review of Microbiology.'' Band 71, 2017, S. 233, [[doi:10.1146/annurev-micro-090816-093830]].</ref> Aufgrund dessen haben CRISPR-Cas-Systeme als wichtige Akteure der antiviralen Abwehrmechanismen sich ebenfalls den evolutionären Änderungen angepasst. Dies resultierte in einer Erhöhung der Diversität hinsichtlich der Genzusammensetzung des ''cas''-[[Operon]]s, der Architektur des CRISPR-[[Genlocus]] und der Gensequenzen (auch innerhalb der Cas-Core-Gene). Bei den Cas-Core-Genen handelt es sich um die ''cas''-Gene ''cas1'' bis ''cas6'', die innerhalb vieler CRISPR-Cas-Systemvarianten [[Konservierung#Evolution|konserviert]] sind.<ref name="Haft" />

Eine einfache und rationale Klassifizierung von CRISPR-Cas-Systemen erweist sich aus folgenden Gründen als vorteilhaft:
* Erklärung der Herkunft und Evolution der Diversität von CRISPR-Cas-Systemen
* Mitverfolgung und Integration neu entdeckter CRISPR-Cas-Systemvarianten
* kohärente [[Annotation#Biologie|Annotation]] von CRISPR-Cas-Genloci in mikrobiellen Genomen

Die seit den Anfängen der CRISPR-Forschung verwendete Klassifizierung von CRISPR-Cas-Systemen anhand der [[Phylogenese]] des Cas1-Proteins<ref name="DOI10.1186/1745-6150-1-7">Kira S. Makarova, Nick V. Grishin, Svetlana A. Shabalina, Yuri I. Wolf, Eugene V. Koonin: ''A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.'' In: ''Biology Direct.'' Band 1, S. 7, [[doi:10.1186/1745-6150-1-7]].</ref> erwies sich nach weiteren Entdeckungen von Genomen mit CRISPR-Cas-Genloci als problematisch, weil die Organisation und Phylogenese der Gene des ''Effektormoduls'' von der Phylogenese des Cas1-Proteins abwich. Unter einem Effektormodul versteht man eine Gruppe von ''cas''-Genen, die zur Identifizierung von [[Genetisches Material|genetischem Material]] dient. Des Weiteren existiert ein ''Adaptationsmodul'', welches ebenfalls ''cas''-Gene umfasst und mithilfe von Effektorproteinen zur Protospacer-Auswahl beiträgt, die in das bakterielle Genom integriert werden können.<ref name="DOI10.1093/nar/gky702">Donghyun Ka, Dong Man Jang, Byung Woo Han, Euiyoung Bae: ''Molecular organization of the type II-A CRISPR adaptation module and its interaction with Cas9 via Csn2.'' In: ''Nucleic Acids Research.'' 46, 2018, S. 9805, [[doi:10.1093/nar/gky702]].</ref><ref name="DOI10.1007/s10539-018-9658-7">Eugene V. Koonin: ''CRISPR: a new principle of genome engineering linked to conceptual shifts in evolutionary biology.'' In: ''Biology & Philosophy.'' Band 34, 2019, [[doi:10.1007/s10539-018-9658-7]].</ref> Ursache für die phylogenetischen Abweichungen ist wahrscheinlich die [[Rekombination (Genetik)|Rekombination]] zwischen den Effektor- und Adaptationsmodulen (englisch ''module shuffling'').<ref name="DOI10.1038/nrmicro3569">Kira S. Makarova, Yuri I. Wolf, Omer S. Alkhnbashi: ''An updated evolutionary classification of CRISPR–Cas systems.'' In: ''Nature Reviews Microbiology.'' Band 13, 2015, S. 722, [[doi:10.1038/nrmicro3569]].</ref><ref name="DOI10.1186/s12862-017-1081-1">Sanjarbek Hudaiberdiev, Sergey Shmakov, Yuri I. Wolf, Michael P. Terns, Kira S. Makarova, Eugene V. Koonin: ''Phylogenomics of Cas4 family nucleases.'' In: ''BMC Evolutionary Biology.'' Band 17, 2017, [[doi:10.1186/s12862-017-1081-1]].</ref> Somit entschied man, dass charakteristische Merkmale des Effektormoduls zum Klassifizierungsmerkmal von CRISPR-Cas-Systemen wurde.

{| class="wikitable"
|+ Klassifizierung von CRISPR-Cas-Systemen<ref name="PMID31857715">K. S. Makarova, Y. I. Wolf, J. Iranzo, S. A. Shmakov, O. S. Alkhnbashi, S. J. Brouns, E. Charpentier, D. Cheng, D. H. Haft, P. Horvath, S. Moineau, F. J. Mojica, D. Scott, S. A. Shah, V. Siksnys, M. P. Terns, Č. Venclovas, M. F. White, A. F. Yakunin, W. Yan, F. Zhang, R. A. Garrett, R. Backofen, J. van der Oost, R. Barrangou, E. V. Koonin: ''Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants.'' In: ''Nature reviews. Microbiology.'' Band 18, Nummer 2, Februar 2020, S. 67–83, [[doi:10.1038/s41579-019-0299-x]], PMID 31857715 (Review).</ref>
!Klasse
!Typ
!Ziel
!Operon-Organisation{{FN|1}}
!Subtyp
!Bakterienstamm
|-
|rowspan="18"| <div style="text-align:center">I</div>
|rowspan="9"| <div style="text-align:center">I</div>
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|style="max-width:100px;"|''cas6'', '''''cas11''''', '''''cas7''''', '''''cas5''''', '''''cas8a1''''', ''cas3’'', ''cas3’’'', ''cas2'', ''cas4'', ''cas1'', ''cas4'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">I-A</div>
|''[[Archaeoglobus fulgidus]]''<br />AF1859, AF1870–AF1789
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|style="max-width:100px;"|''cas6'', '''''cas8b1''''', '''''cas7''''', '''''cas5''''', ''cas3'', ''cas4'', ''cas1'', ''cas2'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">I-B</div>
|''[[Clostridium kluyveri]]''<br /> CKL_2758–CKL_2751
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|style="max-width:100px;"|''cas3'', '''''cas5''''', '''''cas8c''''', '''''cas7''''', ''cas4'', ''cas1'', ''cas2'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">I-C</div>
|''[[Bacillus halodurans]]''<br /> BH0336–BH0342
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|style="max-width:100px;"|''cas3'', '''''cas8u2''''', '''''cas7''''', '''''cas5''''', '''''cas6''''', ''cas4'', ''cas1'', ''cas2'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">I-G</div>
|''[[Geobacter sulfurreducens]]''<br /> GSU0051–GSU0054, GSU0057–GSU0058
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|style="max-width:100px;"|''cas3’'', '''''cas3’’''''', '''cas10d''', '''cas7''', '''cas5''', cas6, cas4, cas1, cas2, ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">I-D</div>
|''[[Cyanothece|Cyanothece sp. 8802]]''<br /> Cyan8802_0527–Cyan8802_0520
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|style="max-width:100px;"|''cas3'', '''''cas8e''''', '''''cas11''''', '''''cas7''''', '''''cas5''''', '''''cas6''''', ''cas1'', ''cas2'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">I-E</div>
|''[[Escherichia coli]] K12''<br /> ygcB–ygbF
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|style="max-width:100px;"|''cas1'', ''cas2'', ''cas3'', '''''cas8f''''', '''''cas5f1''''', '''''cas7f1''''', '''''cas6f''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">I-F1</div>
|''[[Yersinia pseudotuberculosis]]''<br /> YPK_1644–YPK_1649
|-
|<div style="text-align:center"></div>
|style="max-width:100px;"|''tnsA'', ''tnsB'', ''tnsC'', ''tnsD'', '''''cas8f3/cas5f3''''', '''''cas7f3''''', '''''cas6f''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">I-F3</div>
|''[[Vibrio crassostreae]] J5 20''<br /> VCR20J5_310088–VCR20J5_310108
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|''cas1'', ''cas2'', ''cas3'', '''''cas7f2''''', '''''cas5f2''''', '''''cas6f''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">I-F2</div>
|''[[Shewanella putrefaciens]] CN–32''<br /> Sputcn32_1819–Sputcn32_1823
|-
|rowspan="3"| <div style="text-align:center">IV</div>
|<div style="text-align:center">Plasmide<br /><ref name="DOI10.1093/nar/gkz1197">Rafael Pinilla-Redondo, David Mayo-Muñoz, Jakob Russel, Roger A. Garrett, Lennart Randau, Søren J. Sørensen, Shiraz A. Shah: ''Type IV CRISPR–Cas systems are highly diverse and involved in competition between plasmids.'' In: ''Nucleic Acids Research.'' 27. Dezember 2019, [[doi:10.1093/nar/gkz1197]].</ref></div>
|''dinG'', ''cas6'', '''''cas8-like''''', '''''cas7''''', '''''cas5''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">IV-A</div>
|''[[Thioalkalivibrio]] sp. K90mix''<br /> TK90_2699–TK90_2703
|-
|<div style="text-align:center">Plasmide<br /><ref name="DOI10.1093/nar/gkz1197" /></div>
|''cysH-like'', '''''cas8-like''''', '''''cas11''''', '''''cas7''''', '''''cas5''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">IV-B</div>
|''[[Rhodococcus sp. RHA1|Rhodococcus jostii RHA1]]''<br /> RHA1_ro10069–RHA1_ro10072
|-
|<div style="text-align:center">DNA?</div>
| '''''LS''''', '''''cas11''''', '''''cas7''''', '''''cas5''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">IV-C</div>
|''[[Thermoflexia bacterium]]''<br /> D6793_05715–D6793_05700
|-
|rowspan="6"| <div style="text-align:center">III</div>
|<div style="text-align:center">DNA/RNA</div>
|style="max-width:100px;"|''cas6'', '''''cas10''''', '''''cas11''''', '''''cas7''''', '''''cas5''''', '''''cas7''''', ''csm6'', ''cas1'', ''cas2'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">III-A</div>
|''[[Staphylococcus epidermidis]]''<br /> SERP2463–SERP2455
|-
|<div style="text-align:center">RNA?</div>
|style="max-width:100px;"|'''''cas10''''', '''''cas7''''', '''''cas5''''', '''''cas11''''', '''''cas7''''', '''''cas7''''', '''''csx19''''', '''''cas7''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">III-D</div>
|''[[Synechocystis]] sp. 6803''<br /> sll7067–sll7063
|-
|<div style="text-align:center">RNA?</div>
|style="max-width:100px;"|''TPR + caspase'', '''''cas7(3)''''', '''''cas11''''', ''RT'', ''cas1'', ''cas2'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">III-E</div>
|''Candidatus Scalindua brodae''<br />SCABRO_02601,SCABRO_02597,<br />SCABRO_02593,SCABRO_02595
|-
|<div style="text-align:center">DNA?</div>
|style="max-width:100px;"| '''''cas10''''', '''''cas5''''', '''''cas11''''', '''''cas7''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">III-F</div>
|''[[Thermotoga lettingae]] TMO''<br /> Tlet_0097–Tlet_0100
|-
|<div style="text-align:center">DNA/RNA</div>
|'''''cas7''''', '''''cas7''''', '''''cas10''''', '''''cas7''''', '''''cas11''''', '''''cas5''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">III-C</div>
|''[[Methanothermobacter thermautotrophicus]]''<br /> MTH328–MTH323
|-
|<div style="text-align:center">DNA/RNA</div>
|style="max-width:100px;"|'''''cas7''''', '''''cas10''''', '''''cas5''''', '''''cas7''''', '''''cas11''''', ''cas6'', '''''cas7''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">III-B</div>
|''[[Pyrococcus furiosus]]''<br />PF1131–PF1124
|-
|rowspan="26"| <div style="text-align:center">II</div>
|rowspan="4"| <div style="text-align:center">II</div>
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|'''''cas9''''', ''cas1'', ''cas2'', ''cas4'', ''tracrRNA'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">II-B</div>
|''[[Legionella pneumophila]] str. Paris''<br />lpp0160–lpp0163
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|'''''cas9''''', ''cas1'', ''cas2'', ''csn2'', ''tracrRNA'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">II-A</div>
|''[[Streptococcus thermophilus]]''<br />str0657–str0660
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|'''''cas9''''', ''cas1'', ''cas2'', ''tracrRNA'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">II-C1</div>
|''[[Neisseria lactamica]] 020-06''<br />NLA_17660–NLA_17680
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|'''''cas9''''', ''tracrRNA'', ''CRISPR'', ''cas4'', ''cas2'', ''cas1''
|<div style="text-align:center">II-C2</div>
|''[[Micrarchaeum acidiphilum]] ARMAN-1''<br />BK997_03320–BK997_03335
|-
|rowspan="17"| <div style="text-align:center">V</div>
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|'''''[[Cpf1|cas12a]]''''', ''cas4'', ''cas1'', ''cas2'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-A</div>
|''[[Francisella novicida|Francisella cf. novicida]] Fx1''<br />FNFX1_1431–FNFX_1428
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|'''''cas12e''''', ''cas4'', ''cas1'', ''cas2'', ''tracrRNA'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-E</div>
|''[[Deltaproteobacteria bacterium]]''<br />A2Z89_08250–A2Z89_08265
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|'''''[[Cas12b|cas12b1]]''''', ''cas4'', ''cas1'', ''cas2'', ''tracrRNA'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-B1</div>
|''[[Alicyclobacillus acidoterrestris]]''<br />N007_06525–N007_06535
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|''cas4'', ''cas1'', ''cas2'', '''''cas12b2''''', ''tracrRNA'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-B2</div>
|''[[Planctomycetes bacterium]] RBG_13_46_10''<br />A2167_01675–A2167_01685
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|'''''cas12i''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-I</div>
|''Freshwater metagenome (JGI)''<br />Ga0208225_100001036
|-
|<div style="text-align:center"></div>
|'''''cas12h''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-H</div>
|''Hypersaline lake sediment metagenome (JGI)''<br />Ga0180438_100006283
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|''cas1'', '''''cas12c''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-C</div>
|''[[Oleiphilus|Oleiphilus sp.]]''<br />A3715_16885–A3715_16890
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|''cas1'', ''CRISPR'', '''''cas12d'''''
|<div style="text-align:center">V-D</div>
|''[[Bacterium]] CG09_39_24''<br />BK003_02070–BK003_02075
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|''cas1'', ''cas2'', ''cas4'', '''''cas12f1''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-F1</div>
|''Uncultured archaeon''<br />NDOCEIEL_00008–NDOCEIEL_00011
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|'''''c2c10''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-F1<br />(V-U3)</div>
|''[[Bacillus thuringiensis]] HD-771''<br />BTG_31928
|-
|<div style="text-align:center">DNA</div>
|'''''cas12f2''''', ''CRISPR'', ''cas1'', ''cas2'', ''cas4''
|<div style="text-align:center">V-F2</div>
|''Uncultured archaeon''<br />ICDLJNLD_00049–ICDLJNLD_00052
|-
|<div style="text-align:center"></div>
|'''''c2c8''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-U2</div>
|''[[Cyanothece|Cyanothece sp.]] PCC 8801''<br />PCC8801_4127
|-
|<div style="text-align:center"></div>
|'''''c2c9''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-U4</div>
|''[[Rothia dentocariosa]] M567''<br />HMPREF0734_01291
|-
|<div style="text-align:center"></div>
|''cas1'', ''cas2'', ''cas4'', '''''cas12f3''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-F3</div>
|''Candidatus Micrarchaeota archaeon''<br />COU37_03050–COU37_03065
|-
|<div style="text-align:center"></div>
|'''''c2c4''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-U1</div>
|''[[Gordonia otitidis]]''<br />GOOTI_RS19525
|-
|<div style="text-align:center"></div>
|'''''cas12g''''', ''CRISPR'', ''tracrRNA''
|<div style="text-align:center">V-G</div>
|''Hot springs metagenome''<br />FLYL01000025.1 (182949..185252)
|-
|<div style="text-align:center"></div>
|''tnsB'', ''tnsC'', ''tniQ'', '''''cas12k''''', ''tracrRNA'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">V-K<br />(V-U5)</div>
|''[[Cyanothece|Cyanothece sp.]] PCC 8801''<br />PCC8801_2993–PCC8801_2997
|-
|rowspan="5"| <div style="text-align:center">VI</div>
|<div style="text-align:center">RNA</div>
|'''''[[cas13]]a''''', ''cas1'', ''cas2'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">VI-A</div>
|''[[Leptotrichia shahii]]''<br />B031_RS0110445
|-
|<div style="text-align:center">RNA</div>
|''WYL'', '''''cas13d''''', ''cas1'', ''cas2'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">VI-D</div>
|''[[Ruminococcus bicirculans]]''<br />RBI_RS12820
|-
|<div style="text-align:center">RNA?</div>
|'''''cas13c''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">VI-C</div>
|''[[Fusobacterium perfoetens]]''<br />T364_RS0105110
|-
|<div style="text-align:center">RNA</div>
|'''''cas13b1''''', ''csx28'', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">VI-B1</div>
|''[[Prevotella buccae]]''<br />HMPREF6485_RS00335–HMPREF6485_RS00340
|-
|<div style="text-align:center">RNA</div>
|''csx27'', '''''cas13b2''''', ''CRISPR''
|<div style="text-align:center">VI-B2</div>
|''[[Bergeyella zoohelcum]]''<br />HMPREF9699_02005–HMPREF9699_02006
|}
{{FNBox|
{{FNZ|1|Die '''''fett''''' gekennzeichneten Gene stellen Gene von ''Effektorkomplexen'' von CRISPR/Cas-Systemen der Klasse I und Gene von ''Effektorproteinen'' von CRISPR/Cas-Systemen der Klasse II dar.}}}}

== Anwendungen ==
[[Datei:CRISPR overview - de.svg|mini|Verwendungsbeispiel des CRISPR-Cas-Systems in einem Plasmid]]
[[Datei:CRISPR Sterics.svg|mini|Blockade der Genexpression durch eine ''Cas9''-Mutante (''dCas9'') im Zuge der [[CRISPRi]]]]
Das CRISPR-Cas-System kann unter anderem zum [[Genome Editing]] (Deletionen/[[Gen-Knockout]]<ref>O. Shalem, N. E. Sanjana, F. Zhang: ''High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9.'' In: ''Nature reviews. Genetics.'' Band 16, Nummer 5, Mai 2015, S. 299–311, [[doi:10.1038/nrg3899]], PMID 25854182, {{PMC|4503232}} (Review).</ref> und Insertionen) und damit auch zur [[Gentherapie]] verwendet werden.<ref>Y. Wang, Z. Li, J. Xu, B. Zeng, L. Ling, L. You, Y. Chen, Y. Huang, A. Tan: ''The CRISPR/Cas System mediates efficient genome engineering in Bombyx mori.'' In: ''Cell research.'' Band 23, Nummer 12, Dezember 2013, S. 1414–1416, {{ISSN|1748-7838}}. [[doi:10.1038/cr.2013.146]]. PMID 24165890. {{PMC|3847576}}.</ref><ref>T. R. Sampson, D. S. Weiss: ''Exploiting CRISPR/Cas systems for biotechnology.'' In: ''BioEssays: news and reviews in molecular, cellular and developmental biology.'' Band 36, Nummer 1, Januar 2014, S. 34–38, {{ISSN|1521-1878}}. [[doi:10.1002/bies.201300135]]. PMID 24323919.</ref>

Problematisch für humane Anwendungen könnte jedoch sein, dass das [[Immunsystem]] die Endonuklease Cas9, die bakteriellen Ursprungs ist, als [[Antigen]] erkennt. Über 80 % aller gesunden Menschen zeigen sowohl eine Antikörper-basierte [[humorale Immunantwort]] als auch eine auf [[T-Gedächtniszelle]]n basierte [[zelluläre Immunantwort]]. Ursache hierfür ist, dass die meisten Menschen im Laufe ihres Lebens schon einmal mit Bakterien wie ''S. pyogenes'' oder ''S. aureus'' in Kontakt kamen und sich so entsprechende Antikörper und Gedächtniszellen bilden konnten.<ref>D. L. Wagner, L. Amini, D. J. Wendering, L. M. Burkhardt, L. Akyüz, P. Reinke, H. D. Volk, M. Schmueck-Henneresse: ''High prevalence of Streptococcus pyogenes Cas9-reactive T cells within the adult human population.'' In: ''Nature medicine.'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] Oktober 2018, [[doi:10.1038/s41591-018-0204-6]], PMID 30374197.</ref> Körperzellen, deren Genom mit CRISPR-Cas9 editiert wurde, können prinzipiell von [[Cytotoxische T-Zelle|cytotoxischen T-Zellen]] erkannt und durch [[Apoptose]] vernichtet werden. Der therapeutische Effekt wäre somit nicht mehr gegeben. Diese Problematik wird aktuell (Stand 2018) intensiv diskutiert.<ref>J. M. Crudele, J. S. Chamberlain: ''Cas9 immunity creates challenges for CRISPR gene editing therapies.'' In: ''[[Nature Communications]].'' Band 9, Nummer 1, August 2018, S. 3497, [[doi:10.1038/s41467-018-05843-9]], PMID 30158648, {{PMC|6115392}}.</ref><ref name="tagesspiegel-23256828">{{Internetquelle |autor=Sascha Karberg |url=https://www.tagesspiegel.de/wissen/molekulare-medizin-rueckschlag-fuer-gentherapie-mit-crispr/23256828.html |titel=Molekulare Medizin: Rückschlag für Gentherapie mit "Crispr" |werk=[[Der Tagesspiegel|tagesspiegel.de]] |datum=2018-02-22 |abruf=2018-11-06}}</ref><ref name="scinexx-181102">{{Internetquelle |autor=Harald Frater |url=http://www.scinexx.de/wissen-aktuell-23318-2018-11-02.html |titel=CRISPR/Cas9: Genschere mit Nebenwirkungen: Cas9-Enzym der Genschere könnte im Körper ungewollte Immunreaktionen auslösen |werk=scinexx.de |datum=2018-11-02 |abruf=2018-11-06}}</ref>

Weiterhin wird das CRISPR-Cas-System zur Entfernung der Genome von [[Krankheitserreger]]n chronischer [[Infektionskrankheit]]en wie des [[Hepatitis-B-Virus]]<ref>G. Lin, K. Zhang, J. Li: ''Application of CRISPR/Cas9 Technology to HBV.'' In: ''International journal of molecular sciences.'' Band 16, Nummer 11, 2015, S. 26077–26086, [[doi:10.3390/ijms161125950]], PMID 26540039 (Review).</ref> und des [[HIV]]<ref>L. Ye, J. Wang, A. I. Beyer, F. Teque, T. J. Cradick, Z. Qi, J. C. Chang, G. Bao, M. O. Muench, J. Yu, J. A. Levy, Y. W. Kan: ''Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Δ32 mutation confers resistance to HIV infection.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' Band 111, Nummer 26, Juli 2014, S. 9591–9596, [[doi:10.1073/pnas.1407473111]], PMID 24927590, {{PMC|4084478}}.</ref><ref>G. Wang, N. Zhao, B. Berkhout, A. T. Das: ''CRISPR-Cas based antiviral strategies against HIV-1.'' In: ''Virus research.'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] Juli 2017, [[doi:10.1016/j.virusres.2017.07.020]], PMID 28760348.</ref> eingesetzt. Die gezielte Veränderung einzelner Gene wird bei der Charakterisierung von [[Onkogen]]en und somit zur Untersuchung der [[Tumor]]entstehung verwendet.<ref>F. J. Sánchez-Rivera, T. Jacks: ''Applications of the CRISPR-Cas9 system in cancer biology.'' In: ''Nature reviews. Cancer.'' Band 15, Nummer 7, Juli 2015, S. 387–395, [[doi:10.1038/nrc3950]], PMID 26040603, {{PMC|4530801}}.</ref><ref>S. Chen, H. Sun, K. Miao, C. X. Deng: ''CRISPR-Cas9: from Genome Editing to Cancer Research.'' In: ''International journal of biological sciences.'' Band 12, Nummer 12, 2016, S. 1427–1436, [[doi:10.7150/ijbs.17421]], PMID 27994508, {{PMC|5166485}}.</ref>
Das CRISPR-Cas-System wird zur Untersuchung der Funktionen von teilweise unbekannten [[Gen]]en eingesetzt.<ref>T. Wijshake, D. J. Baker, B. van de Sluis: ''Endonucleases: new tools to edit the mouse genome.'' In: ''[[Biochimica et Biophysica Acta]].'' Band 1842, Nummer 10, Oktober 2014, S. 1942–1950, [[doi:10.1016/j.bbadis.2014.04.020]], PMID 24794718.</ref> Zudem wird es zur Korrektur von [[Mutation]]en bei der Erzeugung [[Induzierte pluripotente Stammzelle|induzierter pluripotenter Stammzellen]]<ref>H. L. Li, P. Gee, K. Ishida, A. Hotta: ''Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system.'' In: ''Methods (San Diego, Calif.).'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] Oktober 2015, [[doi:10.1016/j.ymeth.2015.10.015]], PMID 26525194.</ref> und [[Embryonale Stammzelle|embryonaler Stammzellen]] verwendet.<ref>T. Horii, I. Hatada: ''Genome Editing Using Mammalian Haploid Cells.'' In: ''International journal of molecular sciences.'' Band 16, Nummer 10, 2015, S. 23604–23614, [[doi:10.3390/ijms161023604]], PMID 26437403, {{PMC|4632716}} (Review).</ref><ref>E. A. Vasileva, O. U. Shuvalov, A. V. Garabadgiu, G. Melino, N. A. Barlev: ''Genome-editing tools for stem cell biology.'' In: ''Cell death & disease.'' Band 6, 2015, S. e1831, [[doi:10.1038/cddis.2015.167]], PMID 26203860, {{PMC|4650720}} (Review).</ref> Weitere Anwendungen werden untersucht.<ref>N. Savić, G. Schwank: ''Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing.'' In: ''Translational research: the journal of laboratory and clinical medicine.'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] September 2015, [[doi:10.1016/j.trsl.2015.09.008]], PMID 26470680.</ref> Im März 2020 setzten Wissenschaftler erstmals CRISPR-Cas9 in einem menschlichen Körper ein. Sie versuchen in einer [[Klinische Studie|klinischen Studie]] mittels Genome Editing das Sehvermögen eines Patienten mit [[Lebersche Kongenitale Amaurose]] wiederherzustellen, nachdem Tests in menschlichen Zellen, Mäusen und Affen erfolgreich verliefen und sie eine offizielle Genehmigung erhielten. Sie injizieren dazu drei Tropfen mit Milliarden Viren unter die Retina des Patienten. Die Änderung der DNA ist permanent und – anders als beim Human Germline Engineering – nicht [[Vererbung (Biologie)|vererbbar]].<ref>{{cite news |title=Doctors use gene editing tool Crispr inside body for first time |url=https://www.theguardian.com/science/2020/mar/04/doctors-use-gene-editing-tool-crispr-inside-body-for-first-time |accessdate=2020-04-06 |work=the Guardian |date=2020-03-04 |language=en}}</ref><ref>{{cite news |title=Doctors try 1st CRISPR editing in the body for blindness |url=https://apnews.com/17fcd6ae57d39d06b72ca40fe7cee461 |accessdate=2020-04-06 |work=AP NEWS |date=2020-03-04}}</ref><ref>{{cite web |last1=White |first1=Franny |title=OHSU performs first-ever CRISPR gene editing within human body |url=https://news.ohsu.edu/2020/03/04/ohsu-performs-first-ever-crispr-gene-editing-within-human-body |website=OHSU News |accessdate=2020-04-12 |language=en}}</ref> Im Juni 2020 wurden vorläufige Ergebnisse der, im Frühjahr 2019 gestarteten, ersten klinischen Studie zur Behandlung von vererbten genetischen Erkrankungen mittels CRISPR-Cas9 außerhalb von China veröffentlicht. Sie deuten auf einen Erfolg der Behandlung („CTX001“) hin.<ref>{{cite news |title=More early data revealed from landmark CRISPR gene editing human trial |url=https://newatlas.com/medical/early-data-ctx001-crispr-gene-editing-human-trial/ |work=New Atlas |language=en}}</ref><ref>{{cite web |title=CRISPR Therapeutics and Vertex Announce New Clinical Data for Investigational Gene-Editing Therapy CTX001™ in Severe Hemoglobinopathies at the 25th Annual European Hematology Association (EHA) Congress {{!}} CRISPR Therapeutics |url=https://crisprtx.gcs-web.com/news-releases/news-release-details/crispr-therapeutics-and-vertex-announce-new-clinical-data |website=crisprtx.gcs-web.com |accessdate=1 July 2020 |language=en}}</ref> 2021 wurde die erste, kleine klinische Studie [[intravenös]]er CRISPR-Genbearbeitung im Menschen mit erfolgversprechenden Ergebnissen beendet.<ref>{{cite news |last1=Kaiser |first1=Jocelyn |title=CRISPR injected into the blood treats a genetic disease for first time |url=https://www.sciencemag.org/news/2021/06/crispr-injected-blood-treats-genetic-disease-first-time |access-date=2021-07-11 |work=Science {{!}} AAAS |date=26 June 2021 |language=en}}</ref><ref>{{cite journal |last1=Gillmore |first1=Julian D. |last2=Gane |first2=Ed |last3=Taubel |first3=Jorg |last4=Kao |first4=Justin |last5=Fontana |first5=Marianna |last6=Maitland |first6=Michael L. |last7=Seitzer |first7=Jessica |last8=O’Connell |first8=Daniel |last9=Walsh |first9=Kathryn R. |last10=Wood |first10=Kristy |last11=Phillips |first11=Jonathan |last12=Xu |first12=Yuanxin |last13=Amaral |first13=Adam |last14=Boyd |first14=Adam P. |last15=Cehelsky |first15=Jeffrey E. |last16=McKee |first16=Mark D. |last17=Schiermeier |first17=Andrew |last18=Harari |first18=Olivier |last19=Murphy |first19=Andrew |last20=Kyratsous |first20=Christos A. |last21=Zambrowicz |first21=Brian |last22=Soltys |first22=Randy |last23=Gutstein |first23=David E. |last24=Leonard |first24=John |last25=Sepp-Lorenzino |first25=Laura |last26=Lebwohl |first26=David |title=CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis |journal=New England Journal of Medicine |date=2021-06-26 |doi=10.1056/NEJMoa2107454 |pmid=34215024 |url=https://www.nejm.org/doi/10.1056/NEJMoa2107454 |language=en}}</ref>

Mit dem CRISPR-Cas-System wurden unter anderem [[Bakteriophage]]n-resistente Bakterienstämme erzeugt, und dies durch eine adaptive [[Resistenz]] bei Hinzufügen entsprechender RNA bei industriell wichtigen Bakterien, z. B. in der [[Milch]]- oder [[Wein]]industrie. Durch ein mutiertes ''Cas'' ohne funktionsfähige Endonuklease (''dCas9'') kann ein [[DNA-bindendes Protein]] erzeugt werden, das unter anderem analog zur [[RNAi]] zu einem [[Gen-Knockdown|Knockdown]] von endogenen Genen führt,<ref>L. S. Qi, M. H. Larson, L. A. Gilbert, [[Jennifer Doudna|J. A. Doudna]], J. S. Weissman, A. P. Arkin, W. A. Lim: ''Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.'' In: ''Cell.'' Band 152, Nummer 5, Februar 2013, S. 1173–1183, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2013.02.022]]. PMID 23452860. {{PMC|3664290}}.</ref> z. B. durch Transformation mit einem [[Plasmid]], aus dem ''Cas9'' und eine CRISPR-RNA [[Transkription (Biologie)|transkribiert]] wird ([[CRISPRi]]).<ref>M. H. Larson, L. A. Gilbert, X. Wang, W. A. Lim, J. S. Weissman, L. S. Qi: ''CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.'' In: ''Nature protocols.'' Band 8, Nummer 11, November 2013, S. 2180–2196, {{ISSN|1750-2799}}. [[doi:10.1038/nprot.2013.132]]. PMID 24136345. {{PMC|3922765}}.</ref> Ebenso kann im Zuge der [[CRISPRa]] mittels ''dCas9'' als [[Fusionsprotein]] mit einem [[Aktivator (Genetik)|Aktivator]] an einer anderen, bestimmbaren Stelle im Genom eine Transkription eingeleitet werden. Anhand charakteristischer CRISPR-Sequenzen können CRISPR-Cas enthaltende [[Bakterien]]stämme identifiziert werden (''spoligotyping''). Ein [[grün fluoreszierendes Protein]] kann mit einer Cas-[[Mutation|Mutante]] als Fusionsprotein zur Markierung von [[DNA-Sequenz]]en (auch repetitiver Sequenzen wie [[Telomer]]e) verwendet werden.<ref>B. Chen, L. A. Gilbert, B. A. Cimini, J. Schnitzbauer, W. Zhang, G. W. Li, J. Park, E. H. Blackburn, J. S. Weissman, L. S. Qi, B. Huang: ''Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System.'' In: ''Cell.'' Band 155, Nummer 7, Dezember 2013, S. 1479–1491, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2013.12.001]]. PMID 24360272.</ref> Durch das CRISPR-Cas-System konnte die Herstellungszeit von [[Farbmaus|Mäusen]] mit komplexen Genomveränderungen von bis zu zwei Jahren auf wenige Wochen verkürzt werden.<ref name="pmid23643243" />

=== Pflanzenzüchtung ===
Die CRISPR-Methode eröffnet Pflanzenzüchtern die Möglichkeit, Sorten von [[Nutzpflanze]]n auf eine leichtere, effizientere und flexiblere Art zu verändern.<ref>X. Liu, S. Wu, J. Xu, C. Sui, J. Wei: ''Application of CRISPR/Cas9 in plant biology.'' In: ''Acta pharmaceutica Sinica. B.'' Band 7, Nummer 3, Mai 2017, S. 292–302, [[doi:10.1016/j.apsb.2017.01.002]], PMID 28589077, {{PMC|5443236}}.</ref> Für mehrere Nutzpflanzen liegen bereits Studien vor, aber es sind noch keine CRISPR-Pflanzen auf dem Markt.<ref name="Jones">{{Literatur |Autor=Huw D. Jones |Titel=Are plants engineered with CRISPR technology genetically modified organisms? |Sammelwerk=The Biochemist |Band=38 |Nummer=3 |Datum=2016-06 |Seiten=14–17}}</ref><ref name="Schaeffer">{{Literatur |Autor=Scott M. Schaeffer, Paul A. Nakata |Titel=CRISPR/Cas9-mediated genome editing and gene replacement in plants: Transitioning from lab to field |Sammelwerk=Plant Science |Band=240 |Nummer= |Datum=2015 |Seiten=130–142 |DOI=10.1016/j.plantsci.2015.09.011}}</ref><ref name="Cardi">{{Literatur |Autor=Teodoro Cardi, C. Neal Stewart Jr. |Titel=Progress of targeted genome modification approaches in higher plants |Sammelwerk=Plant Cell Reports |Band=35 |Nummer= |Datum=2016 |Seiten=1401–1416 |DOI=10.1007/s00299-016-1975-1}}</ref>

[[Caribou Biosciences]], die 2011 von Doudna und Charpentier gegründete Firma, ging eine strategische Partnerschaft mit [[DuPont Pioneer]] ein. Abhängig vom Ausgang des Patentstreits könnte DuPont daher die Rechte an der Anwendung der Methode bei wichtigen Nutzpflanzen wie Mais, Raps und Sojabohne erhalten und Caribou für kleinere Märkte wie Obst und Gemüse. Unklar ist auch, wie sich der letztendliche Patentinhaber hinsichtlich der [[Lizenzierung]] der Methode verhalten wird.<ref name="Jones" /><ref name="Schaeffer" /> Im September 2016 vergab das Broad-Institut eine (nicht exklusive) Lizenz zur Anwendung der Methode an [[Monsanto]]. Von der Lizenz ausgeschlossen sind [[Gene Drive]] sowie Anwendungen bei [[Tabak]] und die Herstellung steriler Pflanzen.<ref>[https://www.newscientist.com/article/2106946-monsanto-cuts-deal-to-use-crispr-to-engineer-food/ Monsanto cuts deal to use CRISPR to engineer food]. New Scientist, 23. September 2016.</ref>

Gleichzeitig besteht weiterhin Unklarheit bezüglich der Regulierung von CRISPR-Pflanzen (ausschließlich mit Deletionen, ohne Insertionen) in verschiedenen Ländern. Die für die mögliche zukünftige kommerzielle Nutzung von CRISPR-Pflanzen in der Landwirtschaft entscheidende Frage ist, ob diese rechtlich als [[gentechnisch veränderte Pflanze]]n angesehen werden, sofern nur etwas aus dem Genom entfernt und kein [[Transgen]] eingefügt wurde, da gentechnisch veränderte Pflanzen insbesondere in der EU sehr streng reguliert sind.<ref name="Jones" /><ref name="Schaeffer" /><ref name="Cardi" /> Das US-Landwirtschaftsministerium verkündete bereits im April 2016, zwei mit der CRISPR-Methode hergestellte Organismen, einen nicht-bräunenden [[Zucht-Champignon|Champignon]] und einen [[Wachsmais]] mit verändertem [[Stärke]]gehalt, nicht zu regulieren.<ref>Erin Brodwin: [http://www.businessinsider.com/dupont-crispr-corn-in-stores-in-5-years The next generation of GMO food is here, and it’s technically not a GMO]. Business Insider, 18. April 2016.</ref> 2021 gingen in Japan Tomaten mit per CRISPR fünffach erhöhtem Gehalt an, möglicherweise leicht beruhigend wirkendem,<ref>{{cite journal |last1=Boonstra |first1=Evert |last2=de Kleijn |first2=Roy |last3=Colzato |first3=Lorenza S. |last4=Alkemade |first4=Anneke |last5=Forstmann |first5=Birte U. |last6=Nieuwenhuis |first6=Sander |title=Neurotransmitters as food supplements: the effects of GABA on brain and behavior |journal=Frontiers in Psychology |date=2015-10-06 |volume=6 |doi=10.3389/fpsyg.2015.01520|pmid=26500584 |pmc=4594160 }}</ref> [[GABA-Rezeptor|GABA]] auf den öffentlichen Markt.<ref>{{cite news |title=Tomato In Japan Is First CRISPR-Edited Food In The World To Go On Sale |url=https://www.iflscience.com/plants-and-animals/tomato-in-japan-is-first-crispredited-food-to-go-on-sale-/ |access-date=2021-10-18 |work=IFLScience |language=en}}</ref>

=== Tierzüchtung ===
Durch die CRISPR-Cas-Methode kann zum Beispiel das Geschlecht von Tieren beeinflusst werden. In der [[Schweineproduktion|Schweinemast]] könnte dadurch das Problem des Ebergeruchs angegangen werden.<ref>{{Literatur |Autor=Stefanie Kurtz et al. |Titel=Knockout of the HMG domain of the porcine SRY gene causes sex reversal in gene-edited pigs |Sammelwerk=PNAS |Datum=2021 |DOI=10.1073/pnas.2008743118}}</ref>

Um die [[Eintagsküken#Tötung männlicher Eintagsküken|Tötung männlicher Eintagsküken]] zu verhindern, wurden Hühner so verändert, dass männliche Embryos automatisch absterben.<ref>{{Internetquelle |url=https://www.schweizerbauer.ch/tiere/eier-von-gentech-huehner-verpoent/ |titel=Eier von Gentech-Hühner verpönt |werk=schweizerbauer.ch |datum=2022-04-18 |abruf=2022-04-19}}</ref>

=== Bekämpfung von Insekten ===
{{Hauptartikel|Gene Drive#Anwendungen}}

== Entdeckungsgeschichte ==
''Siehe auch: [[CRISPR#Entdeckung und Eigenschaften]]''

Die Entdeckung und Erforschung der CRISPR-Sequenzen und des damit verbundenen CRISPR-Cas-Systems im Immunsystem verschiedener [[Bakterien]] und [[Archaea]] erfolgte in mehreren Schritten seit es im Jahr 1987 zum ersten Mal beschrieben wurde.<ref name="Hardt" /> Obwohl die Funktion von CRISPR-Cas noch nicht bekannt war, wurde es zu Beginn der 1990er Jahre für das sog. [[Spoligotyping]] (die Genom-Typisierung von Bakterien-Isolaten über die Erkennung der unterschiedlichen Spacer innerhalb der direct-repeat-region) genutzt.<ref name="Hardt" />

Vor allem in den frühen 2000ern wurden die Zusammenhänge zwischen den CRISPR-Sequenzen der DNA und den cas-Genen sowie ihre Bedeutung in der Immunabwehr der Bakterien identifiziert. Ab 2008 war bekannt, dass das adaptive CRISPR DNA bindet.<ref>L. A. Marraffini, E. J. Sontheimer: ''CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.'' In: ''Science.'' Band 322, Nummer 5909, Dezember 2008, S. 1843–1845, [[doi:10.1126/science.1165771]], PMID 19095942, {{PMC|2695655}}.</ref>

Im Jahr 2011 zeigte eine Arbeitsgruppe um [[Emmanuelle Charpentier]] und [[Jennifer Doudna]], dass mittels des CRISPR-Cas-Systems der Mikroorganismen spezifische DNA-Ziele in vitro geschnitten werden können.<ref name="Hardt" /><ref>E. Pennisi: ''The CRISPR craze.'' In: ''[[Science]]'' Band 341, Nummer 6148, August 2013, S. 833–836, [[doi:10.1126/science.341.6148.833]], PMID 23970676.</ref> Sie reichten ihre wissenschaftliche Arbeit am 8. Juni 2012 bei der Fachzeitschrift ''[[Science]]'' ein, wo sie am 28. Juni veröffentlicht wurde.<ref name="PMID 22745249" /> Parallel zu ihnen arbeitete eine Arbeitsgruppe um [[Virginijus Šikšnys]] an der Methode, die bereits im April 2012 ihre Arbeit bei ''[[Cell (Zeitschrift)|Cell]]'' einreichten; diese wurde jedoch abgelehnt, wenngleich die Herausgeber von Cell dem Artikel nachträglich eine große Bedeutung zuschrieben.<ref>{{Der Spiegel |ID=166490226 |Autor=Martin Schlak |Titel=Mister Crispr. Wie ein litauischer Biochemiker die Chance seines Lebens verpasste |Jahr=2019 |Nr=43 |Seiten=}}</ref> Im Mai reichten Šikšnys und Kollegen das Papier in den [[Proceedings of the National Academy of Sciences]] (PNAS) ein, wo es am 4. September online veröffentlicht wurde.<ref>G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys: ''Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]]'', Band 109, Nummer 39, September 2012, S. E2579–E2586, [[doi:10.1073/pnas.1208507109]], PMID 22949671, {{PMC|3465414}}.</ref>

Doudna und Charpentier beschrieben, wie sich in einem Bakterium gezielt Abschnitte aus dem Erbgut entfernen lassen. Dem Neurowissenschaftler [[Feng Zhang]] vom [[Massachusetts Institute of Technology]] gelang es später, die CRISPR-Methode nicht nur im Bakterium anzuwenden, sondern für alle Zellen zu optimieren.<ref name="Schadwinkel">[https://www.zeit.de/wissen/2016-06/crispr-deutschland-usa-dna-patent-gentechnik/komplettansicht ''Streit um Ruhm, Ehre und Millionen Dollar''.] [[Die Zeit|Zeit Online]], 22. Juni 2016.</ref> Der Leiter des [[Broad Institute]] und Vorgesetzte von Feng Zhang, [[Eric Lander]], verfasste im Januar 2016 einen Artikel über die Anteile der verschiedenen Wissenschaftler an der Entdeckung des CRISPR-Cas-Systems,<ref>E. S. Lander: ''The Heroes of CRISPR.'' In: ''Cell'', Band 164, Nummer 1–2, Januar 2016, S. 18–28; [[doi:10.1016/j.cell.2015.12.041]], PMID 26771483.</ref> der aufgrund von einseitiger Darstellung und eines vermuteten [[Interessenskonflikt]]s kritisiert wurde.<ref>Tracy Vence: [http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/45119/title/-Heroes-of-CRISPR--Disputed/ ''“Heroes of CRISPR” Disputed''.] In: ''The Scientist'', 19. Januar 2016.</ref><ref>Joel Achenbach: [https://www.washingtonpost.com/news/speaking-of-science/wp/2016/04/21/eric-lander-talks-crispr-and-the-infamous-nobel-rule-of-three/ ''Eric Lander talks CRISPR and the infamous Nobel ‘rule of three’''.] In: ''The Washington Post'', 21. April 2016.</ref><ref>Stephen S. Hall: [http://www.scientificamerican.com/article/the-embarrassing-destructive-fight-over-biotech-s-big-breakthrough/ ''The Embarrassing, Destructive Fight over Biotech’s Big Breakthrough''.] In: ''Scientific American'', 4. Februar 2016.</ref>

Charpentier und Doudna erhielten 2014 für die Entdeckung der CRISPR-Cas-Methode den mit drei Millionen Dollar für jeden Preisträger dotierten [[Breakthrough Prize in Life Sciences]]<ref>{{Internetquelle |url=https://breakthroughprize.org/?controller=Page&action=news&news_id=21 |titel=Recipients Of The 2015 Breakthrough Prizes In Fundamental Physics And Life Sciences Announced |werk=breakthroughprize.org |datum=2014-11-09 |sprache=en |offline=1 |archiv-url=https://web.archive.org/web/20160913180508/https://breakthroughprize.org/?controller=Page&action=news&news_id=21 |archiv-datum=2016-09-13 |abruf=2018-03-07}}</ref> des Jahres 2015 und wurden mit zahlreichen weiteren Preisen bedacht. Im Jahr 2020 erhielten sie den [[Nobelpreis für Chemie]]. Innerhalb der ersten fünf Jahre nach Veröffentlichung ist die Methode eine Standardmethode in Laboren geworden und es wurden darüber in diesen fünf Jahren 2.500 wissenschaftliche Veröffentlichungen publiziert.<ref>A. Pawluk: ''CRISPR: No Sign of Slowing Down.'' In: ''[[Cell (Zeitschrift)|Cell]].'' Band 174, Nummer 5, August 2018, S. 1039–1041, [[doi:10.1016/j.cell.2018.08.010]], PMID 30142340.</ref>

=== Patentstreit ===
Sowohl Doudna und Charpentier (University of California, Berkeley) als auch Zhang (Broad) beantragten grundlegende Patente auf die CRISPR-Cas-Methode. Doudna und Charpentier reichten ihren Antrag beim [[United States Patent and Trademark Office]] (USPTO) im Mai 2012, Zhang im Dezember 2012 ein, und Zhang beantragte ein Schnellverfahren. Zhang wurden im Mai 2014 Patentrechte zugesprochen. Das USPTO begründete diese Entscheidung damit, dass Zhang die Methode für alle Zellen tauglich machte.<ref name="Schadwinkel" /> Doudna und Charpentier reichten Klage beim USPTO gegen diese Entscheidung ein. Das Verfahren zur Klärung der Urheberschaft lief im Januar 2016 an. Broad argumentiert, Berkeley habe die Methode zwar für [[Prokaryoten]] (Bakterien), aber nicht hinreichend für [[Eukaryoten]] (z. B. Mäuse und menschliche Zellen) beschrieben. Berkeley argumentiert, der Schritt von Pro- zu Eukaryoten bedürfe keiner [[Patent#Materielle Voraussetzungen|erfinderischen Tätigkeit]].<ref name="Ledford2">{{Literatur |Autor=Heidi Ledford |Titel=Titanic clash over CRISPR patents turns ugly |Sammelwerk=Nature |Band=537 |Nummer= |Datum=2016-09-22 |Seiten=460–461 |DOI=10.1038/537460a}}</ref> Im Februar 2017 entschied das USPTO zugunsten von Broad und lehnte die Klage der University of California mit der Begründung ab, dass die Anwendung der von Doudna und Charpentier beschriebenen CRISPR-Cas-Methode auf Eukaryoten nicht offensichtlich sei.<ref>[http://www.ipwatchdog.com/wp-content/uploads/2017/02/CRISPR-ruling-02-15-2017.pdf Interference 106,048] (PDF; 487 kB) USPTO, 15. Februar 2017.</ref> Im März 2022 sprach das US-Patentamt dem Broad Institute of MIT and Harvard das Recht an der CRISPR-Cas-Methode zu, weil Zhang als Erster deren Einsatz in Eukaryoten – und damit auch in menschlichen Zellen – publiziert habe.<ref>{{Internetquelle |autor=Veronika Szentpetery-Kessler |url=https://www.heise.de/hintergrund/Gen-Editier-Methode-CRISPR-US-Patentamt-trifft-ueberraschende-Entscheidung-6542849.html |titel=Gen-Editier-Methode CRISPR: US-Patentamt trifft überraschende Entscheidung |werk=Heise Online |datum=2022-03-09 |sprache=de |abruf=2022-03-10}}</ref><ref>{{Internetquelle |autor=Kevin E. Noonan |url=https://www.patentdocs.org/ |titel=PTAB Holds for Broad in CRISPR Interference: The Reasoning |werk=Patent Docs |datum=2022-03-07 |sprache=en |abruf=2022-03-10}}</ref>

Auch das [[Europäisches Patentamt|Europäische Patentamt]] (EPA) muss im Patentstreit Entscheidungen fällen. Hinsichtlich des Berkeley-Patentantrags hat das EPA bereits argumentiert, der Antrag habe die Erfindung nicht ausreichend beschrieben, da die Hervorhebung der Rolle der PAM-Sequenzen fehle. Berkeley vertritt die Ansicht, dass diese Rolle für Fachleute offensichtlich ist. Dem Broad-Institut wurden hingegen bereits mehrere Patente an der CRISPR-Cas-Methode zugesprochen, die jedoch von mehreren Seiten angefochten wurden. Kläger verweisen zum Beispiel darauf, dass Broads ursprünglicher Patentantrag einen Wissenschaftler der [[Rockefeller University]] als an der Erfindung Mitbeteiligten erwähnte, eine spätere Version des Antrags jedoch nicht.<ref name="Ledford2" />

Derweil kündigte die UC Berkeley im Mai 2021 an, dass sie NFTs zum Zweck der Offenlegung des Patents unter anderem der CRISPR-Cas-Methode versteigern würde. Hierbei würde die Universität weiterhin der Patenteigentümer sein: Die NFTs stehen lediglich im Zusammenhang mit dem Formular der Patentoffenlegung der Universität, bei dem es sich um ein internes Dokument handelt, welches von der Universität für Forschende genutzt wird, um Erfindungen offenzulegen.<ref>{{Internetquelle|autor=Emma Whitford|titel=UC Berkeley Will Auction NFTs for 2 Nobel Prize Patents|url=https://www.insidehighered.com/quicktakes/2021/05/28/uc-berkeley-will-auction-nfts-2-nobel-prize-patents|datum=2021-05-28|abruf=2023-02-21|werk=Inside Higher Ed|sprache=en}} Siehe auch {{Literatur|Autor=Andrea Sestino, Gianluigi Guido, Alessandro M. Peluso|Titel=Non-Fungible Tokens (NFTs). Examining the Impact on Consumers and Marketing Strategies|Auflage=1|Verlag=Palgrave|Datum=2022|Seiten=28|DOI=10.1007/978-3-031-07203-1|Online={{Google Buch|BuchID=EQMqzwEACAAJ}}}}</ref> 85 % der durch die gesamte Kollektion entstandenen Einnahmen sollten laut der entsprechenden Verlautbarung zur Forschungsfinanzierung verwendet werden.<ref>{{Internetquelle|url=https://www.nytimes.com/2021/05/27/science/nobel-prize-nft-berkeley.html|werk=New York Times|autor=Kenneth Chang|titel=You Can Buy a Piece of a Nobel Prize-Winning Discovery|abruf=2023-02-21|datum=2021-05-27|sprache=en}} Vgl. {{Literatur|Autor=Lawrence J. Trautman|Titel=Virtual Art and Non-Fungible Tokens|Sammelwerk=Hofstra Law Review|Band=50|Nummer=361|Datum=2022|Seiten=369 f.|DOI=10.2139/ssrn.3814087}}</ref> Das als ''The Fourth Pillar'' (dt. „Die vierte Säule“) bezeichnete Werk wurde im Juni 2022 für 22 Ether (zum damaligen Zeitpunkt circa 54.000 US-Dollar) versteigert und von einer Gruppe Absolventen der UC Berkeley aufgekauft. Das Geld wurde für Forschungszwecke verteilt.<ref>{{Literatur|Autor=Nicola Jones|Titel=How scientists are embracing NFTs|Datum=2021-06-18|DOI=10.1038/d41586-021-01642-3|Sammelwerk=Nature|Band=594|Seiten=482}}</ref>

== Risiken ==
Die Methode ist eine verhältnismäßig einfache, preiswerte, leicht verfügbare, punktgenaue und effiziente Technik. In den ersten Jahren war nicht geregelt, ob reine Deletionen, die auch durch zufällige Mutagenese im Rahmen einer [[Züchtung]] entstehen können (jedoch bei der Züchtung nicht zielgerichtet), als [[Gentechnik]] zu bewerten sind. Kritiker weisen darauf hin, dass es beispielsweise internationaler Standards und Vorsorgemaßnahmen bedürfe, um Wildwuchs und Missbrauch vorzubeugen. Hier bestehen auch Befürchtungen vor kriminellen oder terroristischen Anwendungen; das amerikanische [[Federal Bureau of Investigation|FBI]] beispielsweise beobachtet entsprechende mehr oder weniger private [[Do-it-yourself-Biologie|Do-it-Yourself (DIY)-„Garagen-Bastler“]] („Bio-Hacker“). In Bezug auf den Eingriff in die menschliche [[Keimbahn]] durch Verwendung einer CRISPR-Cas-Methode auf menschlichen Keimzellen in Verbindung mit einer [[In-vitro-Fertilisation]] im Rahmen einer Gentherapie gibt es [[Bioethik|bioethische]] Bedenken.<ref>A. Plaza Reyes, F. Lanner: ''Towards a CRISPR view of early human development: applications, limitations and ethical concerns of genome editing in human embryos.'' In: ''Development.'' Band 144, Nummer 1, 01 2017, S. 3–7, [[doi:10.1242/dev.139683]], PMID 28049687.</ref> Der frankokanadische Neurologe Jean-François Gariépy warnt in der Monografie ''The revolutionary phenotype'' vor einer Genmodifizierung von Menschen. Aufgrund der Komplexität von Genmodifikationen sei eine auf Computerprogramme gestützte Änderung des menschlichen Erbguts unumgänglich. Ausgehend von der [[RNA-Welt-Hypothese]], wonach RNA-basierte Lebensformen durch DNA-basierte abgelöst wurden, argumentiert Gariépy, dass eine solche Vorgehensweise auf lange Sicht ebenfalls zu einer revolutionären Umwandlung der menschlichen Lebensform mit nicht absehbaren Folgen führen könne.<ref>{{Literatur |Autor=Jean-François Gariépy |Hrsg=Elora Editions |Titel=The revolutionary phenotype |Ort= |Datum=2019 |ISBN=978-1-72986-156-1 |Seiten=93–96}}</ref> Der [[Deutscher Ethikrat|Deutsche Ethikrat]] warnt vor „unerwünschten gesundheitlichen Folgen“ angesichts noch unausgereifter Verfahren. Zudem bestünden nicht absehbare ethische Folgen.<ref>{{Internetquelle |url=https://www.zeit.de/wissen/gesundheit/2019-12/crispr-forscher-urteil-haft-china-genmanipulation-embryos |titel=Crispr. Chinesische Forscher wegen Genmanipulation zu Haftstrafen verurteilt |werk=Zeit Online |datum=2019-12-30 |sprache=de |abruf=2020-08-13}}</ref>

== Recht ==
Der [[Europäischer Gerichtshof|Europäische Gerichtshof]] (EuGH) entschied am 25. Juli 2018, dass [[grundsätzlich]] auch mit der CRISPR-Cas-Methode (Mutagenese) bearbeitete Pflanzen ohne Fremd-DNA als [[Gentechnisch veränderter Organismus|gentechnisch veränderte Organismen]] (GVO) anzusehen sind und grundsätzlich den in der [[GVO-Richtlinie]] vorgesehenen Verpflichtungen unterliegen (Az. C-528/16). Geklagt hatte die französische Bauerngewerkschaft [[Confédération paysanne]] und weitere acht Verbände gegen die französische Regierung.<ref>{{Internetquelle |url=https://curia.europa.eu/jcms/upload/docs/application/pdf/2018-07/cp180111de.pdf |titel=Gerichtshof der Europäischen Union: Pressemitteilung Nr. 111/18 – Urteil in der Rechtssache C-528/16 |werk=[[Europäischer Gerichtshof]] |datum=2018-07-25 |format=PDF |abruf=2018-07-27}} bzw. [http://curia.europa.eu/juris/documents.jsf?num=C-528/16 ''Ergebnisliste C-528/16'']</ref>

Das Urteil wurde von Umweltschützern gelobt, während Naturwissenschaftler die Auswirkungen kritisch beurteilten, da die Entfernung von DNA auch durch klassische Methoden der Züchtung erreicht würde, wie eine Behandlung mit radioaktiver Strahlung oder mit erbgutverändernden Chemikalien (deren Erzeugnisse nicht als GVO klassifiziert werden), allerdings erfolgen klassische Methoden nach dem Zufallsprinzip.<ref name="spektrum-580714">{{Internetquelle |url=https://www.spektrum.de/kolumne/der-lange-schatten-der-ideologien/1580714 |titel=Crispr/Cas-Urteil des EuGH: Der lange Schatten der Ideologien |werk=spektrum.de |datum=2018-07-25 |abruf=2019-01-21}}</ref> Es sei fraglich, ob von nun an noch Forschungsförderung für entsprechende Projekte gewährt werde. Zudem ist die Zulassung aufwändiger.<ref name="spektrum-580714" /> Auch sei die diesbezügliche Forschung innerhalb der EU für Unternehmen unter den neuen rechtlichen Rahmenbedingungen nicht mehr profitabel. Deshalb werde sie nicht mehr innerhalb der EU erfolgen.<ref>{{Literatur |Autor=Ewen Callaway |Titel=CRISPR plants now subject to tough GM laws in European Union |Sammelwerk=Nature |Band=560 |Nummer=7716 |Datum=2018-07-25 |ISSN=0028-0836 |Seiten=16–16 |Online=http://www.nature.com/articles/d41586-018-05814-6 |Abruf=2018-08-03 |DOI=10.1038/d41586-018-05814-6}}</ref> Weiterhin wurden nachteilige Auswirkungen auf den Welthandel befürchtet.<ref>{{Literatur |Autor=Kai Kupferschmidt |Titel=EU verdict on CRISPR crops dismays scientists |Sammelwerk=Science |Band=361 |Nummer=6401 |Datum=2018-08-03 |ISSN=0036-8075 |Seiten=435–436 |Online=http://science.sciencemag.org/content/361/6401/435 |Abruf=2018-08-03 |DOI=10.1126/science.361.6401.435 |PMID=30072518}}</ref>

Die [[Europäische Kommission]] hat im Sommer 2023 vorgeschlagen, gen-editierte Pflanzen bei der Zulassung genauso zu behandeln wie herkömmliche [[Pflanzenzüchtung]]en. Das läuft auf eine Anmeldepflicht ohne weitere Sonderregeln hinaus. Bedingung ist, dass diese Pflanzen auch auf natürlichem Wege oder durch gezielte Züchtung – etwa durch [[Kreuzung (Genetik)|Kreuzung]] oder [[Auslesezüchtung|Auslese]] – entstanden sein könnten.
<br/>Das [[Europäisches Parlament|Europäische Parlament]] hat sich am 8. Februar 2024 mit einer Mehrheit von 307 zu 263 Stimmen und 41 Enthaltungen hinter den Kommissionsvorschlag für die neue Gentechnik-Verordnung gestellt. Anders als die Kommission fordern die Europaabgeordneten allerdings eine Kennzeichnungspflicht von Waren (etwa im Einzelhandel), die durch neue genomische Techniken erzeugte Bestandteile enthalten. Die EU-Kommission hatte nur vorgeschlagen, das [[Saatgut]] zu kennzeichnen. Dies soll verhindern, dass das Saatgut versehentlich im [[Ökolandbau]] verwendet wird. Dort soll es, so auch der Beschluss des Europäischen Parlaments, verboten bleiben.<ref>Hendrik Kafsack (FAZ): [https://www.faz.net/aktuell/wirtschaft/klima-nachhaltigkeit/genschere-in-der-kritik-warum-die-eu-den-weg-trotzdem-frei-machen-will-19503518.html ''Jetzt will die EU den Weg für die Genschere frei machen''] FAZ / faz.net vom 9. Februar 2024.</ref>

== Siehe auch ==
[[Agrogentechnik]]

== Literatur ==
* Marlene Belfort, Richard P. Bonocora: ''Homing endonucleases: from genetic anomalies to programmable genomic clippers.'' In: ''Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).'' Band 1123, 2014, S. 1–26, {{DOI|10.1007/978-1-62703-968-0_1}}, PMID 24510256, {{PMC|4436680}}.
* Jim Kozubek: ''Modern Prometheus.'' Cambridge University Press, 2016, ISBN 978-1-316-78098-5.
* Jennifer A. Doudna, Samuel H. Sternberg: ''Eingriff in die Evolution: Die Macht der CRISPR-Technologie und die Frage, wie wir sie nutzen wollen.'' Springer Verlag, Berlin Heidelberg, 2018, ISBN 3-662-57444-6.

== Weblinks ==
* [[Peter Kreysler]]: [http://www.deutschlandfunk.de/schoepfung-mit-der-genschere-die-dna-revolution.1247.de.html?dram:article_id=397842 ''Schöpfung mit der Genschere – Die DNA-Revolution''.] [[Deutschlandfunk]] ''Das Feature'', 5. Dezember 2017,
* [https://www.leopoldina.org/themen/genomchirurgie/genomchirurgie-crispr/ ''Genomchirurgie CRISPR''.] [[Leopoldina]].
* [https://www.youtube.com/watch?v=ouXrsr7U8WI ''Gen-editing mit CRISPR/Cas9'']: Animation zum Prinzip der Methode auf dem [[YouTube|youtube-Kanal]] der [[Max-Planck-Gesellschaft]], 10. Februar 2016, mit englischen Untertiteln
* Heidi Ledford: [http://www.spektrum.de/news/gentechnik-crispr-erleichtert-die-manipulation/1351915 ''Werkzeug der Genmanipulation – Gentechnik: CRISPR verändert alles''.] [[spektrum.de]], 24. Juni 2015.
* Daniela Albat: [https://www.wissenschaft.de/gesundheit-medizin/crispr-babys-fataler-eingriff/ ''Crispr-Babys: Fataler Eingriff?''] [[Bild der Wissenschaft|wissenschaft.de]], 3. Juni 2019.

== Einzelnachweise ==
<references />

{{Normdaten|TYP=s|GND=1116100770}}

[[Kategorie:Nukleinsäure-Methode]]
[[Kategorie:Gentechnik]]
[[Kategorie:Gentherapie]]

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CRISPR/Cas-Methode